茶氨酸的制备及应用研究进展江春柳“2孙云1岳鹏翔2(1福建农林大学园艺学院茶学系福建福州3500022大闽食品(漳州)有限公司博士后科研工作站福建漳州 363000) 茶叶含有多种活性成分，其中有三大茶叶提取物已得到公认，即茶多酚(儿茶素)、茶多糖和茶氨酸。
被称为“天然镇静剂”的茶氨酸已成为近几年国际市场上最热销的天然保健产品“新宠”之一。
茶氨酸(L．Theanine)系统命名为：N．乙基吖一L一谷氨酰胺Ⅲ一ethyl—L—glutamine)，是1950年日本学者酒户弥--fig在研究玉露茶鲜爽滋味成分的过程中，从新梢中分离鉴定出的非蛋白特征氨基酸?。
迄今为止，除在茶梅、山茶、油茶、蕈等四种天然植物中检测出其微量存在外，其他植物中尚未发现茶氨酸删。
茶氨酸占干茶总重的l％～2％，占茶树体内游离氨基酸总量的50％以上口1。
自然界存在的茶氨酸均为L型，纯品为白色针状结晶，熔点217～218℃，比旋光度【Q】％=o．70，极易溶于水，其味阈值为0．06％，具有焦糖香和类似味精的鲜爽味，能消减咖啡碱和儿茶素引起的苦涩味，是茶叶中的重要呈味物质，还可以缓解其它食品的苦味和辣味，达到改善食品风味的目的u’2。
1。
1茶氨酸的制各方法自然界中L．茶氨酸含量极少，近20年来对茶氨酸的制备开发得到了茶学、食品、精细化工及制药等领域众多研究者的关注，并通过各种途径制备和生产茶氨酸。
茶氨酸的主要制备途径有：化学合成法、微生物发酵制备法、植物组织培养法和天然茶氨酸的提取分离法。
1．1化学合成法化学方法合成茶氨酸，已有大量的研究报道和专利发表，比较成熟的主要有以下三种：(1)L．谷氨酸加热脱水生成L一吡咯烷酮酸，加铜盐后，与无水乙胺反应，最后进行脱铜反应生产L-茶氨酸。
谷氨酸的吡咯烷酮化法采用无水乙胺(沸点为17℃)为原料，在高压条件下合成茶氨酸，对生产设备、安全性都提出很高要求，且反应时间长。
(2)用N．取代的L．谷氨酸酯的乙胺解反应产生N．取代L．茶氨酸，再脱除保护基获得L一茶氨酸。
酒户弥二朗嗡1于1950年提出以L．谷氨酸．丫．乙基酯为原料，采用氯甲酸苄酯保护氨基后，与乙胺水溶液反应，再用Pd／C催化还原合成L一茶氨酸。
该法的缺点是需要用贵金属钯作催化剂，生产成本高。
王三永，李晓光m1等受此方法启示，改用三苯基氯甲烷保护氨基，在40℃脱去下反应48 h，接着与乙胺水溶液在室温下反应48 h，再在乙酸水溶液中回流5 min脱去三苯甲基，得到L．茶氨酸，产率为39％，质量分数大于98％。
此法存在反应时间过长，产率低等缺点。
(3)L．谷氨酸甜氨基用保护基保护，使其分子内脱水生成环状L．谷氨酸酐后，直接与乙胺作用生成N．取代L．茶氨酸，再除去保护基得到L．茶氨酸。
钱绍松，陈然m等以廉价的L一谷氨酸为原料，采用邻苯二甲酰基作为保护基，保护L一谷氨酸的小氨基，醋酐回流10 rain使其分子内脱水生成N一邻苯二甲酰．L．谷氨酸酐，在常温、常压条件下，分别与2 mol／L氨水和2 mol／L乙胺水溶液反应生成中间产物N．邻苯二甲酰．L一谷氨酰胺、N-邻苯二甲酰．L广茶氨酸，中间产物在室温条件下与0．5 moI_IL水合肼反应48 h脱除保护基，分别以57％、61％的回收率得到L一谷氨酰胺和L．茶氨酸。
化学合成法具有价格低、成本低、易于工业化的优点。
但是化学合成法存在原料不易得、有污染、有毒性和难于提纯等缺点。
而且化学合成直接得到的茶氨酸都是D，L．型消旋体，需要进行拆分才能得到L．型产品【l】。
利用微生物发酵生产的酶拆分D，L广茶氨酸一定程度上解决了化学合成茶氨酸的技术难题。
郭丽芸，刘毅埔1等人已成功的利用刺孢小克银汉霉9980(Cunnighamelia echinulata 9980，CE 9980)，拆分N．乙酰一D，L．茶氨酸获得光学纯的L．茶氨酸，此外米曲霉氨基酰化酶旧1也可以用于D，L一茶氨酸的拆分。
1．2徽生物发酵制各法近几年来，随着生物技术的发展和应用，利用微生物发酵来生产酶，再利用酶的提取物来生产茶氨酸的方法被广泛应用。
日本最初从硝基还原假单孢菌(Pseudomonas nitroreducens)中提取谷氨酰胺酶。
谷氨酰胺酶具有水解谷氨酰胺和谷氨酰基转移能力，能将谷氨酰胺基团转移到乙胺上，形成茶氨酸。
通过添加1．5 moFL的乙胺，使其与0．7 moFL的谷氨酰胺反应，可以生成茶氨酸270 mmol／L(47g／L)n0‘。
此外，日本立木隆等从自然界的土壤中分离、选定的香茅醇假单孢菌GEA是属于假单孢菌属香茅种(Citrondlosis)，具有Y一谷氨酰基转移反应的茶氨酸生产菌。
该菌在pH 9～10，O．3 moFL的乙胺和0．9 moFL的谷氨酰胺条件下反应，能得到40 g／L的茶氨酸[Ill。
茶氨酸的合成还可以运用细菌中的谷氨酰胺合成酶提取物在特殊的条件下(高乙胺浓度和特定的pH值)进行非特异反应?，但谷氨酰胺属于连接酶，需要提供能量ATP。
在200 mmol／L谷氨酸钠，1．2 m01／L乙胺，300 mmol／L 葡萄糖，50 nunol／L磷酸钾缓冲盐的条件下，通过添加1 00 U／mL的谷氨酰胺合成酶和60 mg／mL的酵母细胞，48 h内就能合成170 mmoFL(30 g／L)茶氨酸u“。
随着人们对丫．谷氨酰转肽酶(丫．Glutamyltran speptidase，7-GGT)催化机理及分子结构的不断深入，利用GGT制备系列卜谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点u引。
，／-GGT，是生物体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一。
1，．GGT既可以催化转移丫．谷氨酰基化合物上的丫一谷氨酰基到氨基酸、多肽等受体上，也可以催化Y一谷氨酰基化合物水解反应生成r谷氨酸n利。
1986年日本京都大学的Hideyuki Suzuki分离纯化了大肠杆菌K一12中的p谷氨酰基转肽酶，通过基因工程方法构建得到产酶的菌株Escherichia coli K．12strain SH642，在200 mmoFL L-谷氨酰胺，1．5 mol／L乙胺，0．4U／mL GGT，37℃，2 h合成L．茶氨酸，得到120 mmoFL茶氨酸，谷氨酰胺转化率达60％n副。
2007年王丽鸳，王贤波“刮等人将E．coli DH5a的7-GGT基因，转入到pET-32ar中，构建了具有较高茶氨酸生物合成能力的基因工程菌，以L．谷氨酰胺和盐酸乙胺为底物可生产29．40 g／L的茶氨酸，L．谷氨酰胺转化率为48．22％，低于Suzuki等60％的谷氨酰胺转化率u“。
利用微生物发酵或酶法生产茶氨酸涉及到酶活性的保持及反应条件，如底物浓度、温度和pH等的调控问题。
这些条件与转化率、产率及生产效率关系密切。
技术条件要求高，操作复杂，工业化生产难度较大。
1．3植物组织培养法生产茶氨酸植物组织培养法生产茶氨酸就是采用茶树细胞培养来产生茶氨酸，或者采用茶树愈伤组织培养来产生茶氨酸，然后通过离子交换法从茶树愈伤组织中提取茶氨酸Ⅲ1。
人们用14C标记的方法早已证实了茶树中茶氨酸的合成前体是谷氨酸和乙胺n1。
茶树愈伤组织有合成茶氨酸的能力。
日本学者已经证实向培养基中添加盐酸乙胺时，可大幅度提高愈伤组织中的茶氨酸合成量n8“引。
吕虎口0。
、钟俊辉但¨等研究也表明，添加盐酸乙胺后对茶氨酸合成量的影响非常明显。
当培养基中盐酸乙胺的浓度为25 mol／L时，茶叶愈伤组织的茶氨酸生物合成为最大值。
这证实前体物质能促进或诱导细胞中茶氨酸合成活性，使细胞充分利用前体进行茶氨酸合成；在培养基中保持一定量的盐酸乙胺有利于提高茶氨酸合成积累量。
采用组织培养的方法，通过系列组织的优化，如增加蔗糖浓度、减少光照、添加前体物质盐酸乙胺、使用生长激素等能提高茶氨酸的积累妇‘一刳。
通过一系列上述条件优化，使茶氨酸在茶愈伤组织(干质量)中的含量达200 mg／g以上幢¨。
用80％热乙醇浸提经干燥、粉碎后的茶愈伤组织，经过滤浓缩后上柱分离纯化，可得纯品乜31。
1．4天然茶氨酸的提取分离法1．4．1从茶叶中提取茶氨酸易溶于水，在高温、酸碱和长时间提取条件下稳定性较强，便于用天然产物工程和精细化工手段浸提和制备。
茶叶中的天然茶氨酸可以采用热水或冷乙醇提取，分别用氯仿、醋酸铅除去提取液中的咖啡碱、茶多酚和树胶类杂质。
滤液中加入碱式碳酸铜，便可析出茶氨酸一铜盐，再用稀硫酸转溶，通入H2S和加入适量Ba(OH)2，滤除沉淀后，可得到茶氨酸净化液H1。
但是茶叶中仅含有l％～P沉淀2％的茶氨酸，而且提取纯化工艺，容易被Pb2+、Cu2+、S2-等离子污染，同时茶氨酸容易受硫酸钡沉淀析出而损失，因此不利于工业化生产。
1．4．2从茶多酚工业废液中提取茶多酚生产企业的工业废液中含有约2％左右的茶氨酸，如能利用茶多酚工业废液为原料提取纯化茶氨酸，不仅产品成本相对较低，而且可以很好的解决茶多酚生产厂家的工业废液的出路问题，具有较好的应用前景。
从茶多酚工业废液为原料提取纯化茶氨酸的工艺路线如下：茶多酚工业废液一絮凝一澄清液一吸附一过柱液一离子交换树脂一过柱液I茶氨酸产品一重结晶一浓缩一洗脱林智，杨勇晗钔等人采用絮凝、吸附、阳离子树脏的转移，这一研究结果表明，茶氨酸不仅增加了脂交换、重结晶工艺来分离纯化茶氨酸。
结果表明，抗癌药物对原发癌的抗癌活性，而且对癌细胞的转絮凝能有效的去除茶多酚工业废液中的蛋白质等移也有抑制作用，他们预计不久茶氨酸在抗肿瘤上杂质，杂质的去除率为50％；吸附能进一步去除的功能可作为化学疗法用于癌症的临床治疗阻”。
色素、多酚类物质及大分子有机物；阳离子交换树 2001年，SadzukaY等进一步研究了茶氨酸提高抗脂能较专一吸附氨基酸。
茶多酚工业废液经上述工癌药阿霉素(DOX)抗癌活性的途径，提高其抗癌艺可得纯度为50％的茶氨酸，得率为1．8％；通过疗效啪1。
重结晶可得到纯度90％的茶氨酸，得率为0．8％。
2茶氨酸的应用2．1茶氨酸在医学上的应用2．1．1茶氨酸具有抗肿瘤作用茶氨酸是谷氨酰胺的衍生物，而肿瘤细胞的谷氨酰胺代谢比正常细胞活跃得多。
因此，茶氨酸作为谷氨酰胺的竞争物，通过干扰谷氨酰胺的代谢来抑制癌细胞的生长晗51。
1999年，SugiyamaT．等研究了更新的抗癌药物Pirarubicin的膜传输和抗肿瘤活性，并将其与抗癌阿霉素(Doxorubicin)进行了比较。
同时研究了茶氨酸对Pirarubicin药效的影响，发现茶氨酸能阻止Pirarubicin流出M5076肿瘤细胞，使Pirarubicin在肿瘤细胞中的浓度增加了113倍，使Pirarubicin的治疗效果提高了117倍汹1。
SugSugiyama T．等还发现茶氨酸与抗癌药阿霉素(Doxorubicin)联合使用能抵抗卵巢瘤向肝2．1．2茶氨酸有降压作用降压的机理是通过影响末梢神经的血管系统来实现的晗引。