ｄｕｃｏｓｅ
ｗｅｒｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｍｔｉｏｎ ｉｎ Ｔ２ＤＭ ｐａ—
ｔｉｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｍｉｄｅｓ／Ｃ１０ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ
ｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍａ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｍｐｏｓｊｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｃｏｕｎｔｓ（尸＝０．５８６，Ｐ＝０．３９４，Ｐ＝０．６１ｌ，Ｐ＝０．２７０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｃｏｍｐａｒｅ
ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｌｌｅ Ｃｌｏｓ— Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉ・
ｏｒ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ，Ｂｉ６ｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｕｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｍｌｙ ｃａｎｔｌｙ
ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｆｆ）Ｇ）ａｎｄ
ｍｉ・
ｃｒｏｂｉｏｔａ；ｆｕｒｔｈｅ珊ｏｒｅ，ｔｏ
ｏｆ他ＤＭ． Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ ｊｎｃｌｕｄｅｄ ５５ ７Ｉ＿２ＤＭ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ５７ ｈｅａｌＩｈｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ． ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ
ｗａｓ
ｎｏ
Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｍｃｔｅｄ ｆｍｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｓｔ００ｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｅ
ｉｎ
ｃｏｕｎｔｓ
ｓｉｇｎｉ矗ｃａｎｔｌｙ ｎｅｇａｔｉＶｅｌｙ ｃｏⅡｅ— ‘ｒ２ＤＭ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｐ＝０．００９
ａＩｌｄ
Ｐ＝０．０３３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｃｏｎｃｌｌｌｓｉｏｎ
ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｍｂｉｏｔａ．Ｔｈｅ ｍｏｄｉ６ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｍｂｉｏｔａ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｉｎ ｐｌａｓｍａ
ｄｕｃｏｓｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ７１２ＤＭ ｐａｔｉｅｎｔ． ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ；ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｔｅｔｓ；ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉＶｅ ＰｃＲ
【Ｋｅｙ ｗｏ“Ｉｓ】
随着社会的发展和人们生活方式的改变，糖尿 病、肥胖等代谢性疾病迅速发展，已成为全球最突出的 社会问题。２０１１年中国糖尿病协会最新调查发现，中 国糖尿病发病率高达９．７％，全国糖尿病患者达到１亿 例，糖尿病及其慢性并发症对人类健康产生极大的危 害，给社会和家庭带来沉重的负担。近年来随着研究 的逐步深入，人们发现糖尿病和肥胖以胰岛素抵抗和
析。将待测粪便ＤＮＡ稀释为５ ｎｇ／灿浓度作为定量 ＰｃＲ反应模板，在上述反应体系、反应条件下进行荧光 定量扩增。结果以细菌拷贝数的常用对数１９／ｇ粪便 表示。
万方数据
・２００８・
广东医学２０１３年７月第３４卷第１３期
Ｇｕ粕ｇｄｏ呜Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｊｏ啪ａｌ
Ｊｕｌ．２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１３
【关键词】
肠道茵群；２型糖尿病；实时荧光定量ＰｃＲ
Ｔｈｅ ｉｎｔ船ｔｉＩｌａｌ ＩＩＩｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｌｌ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔ鹤ｐａｔｉｅｎｔｓ．
肌ⅣＧ胁ｉ—ｆ垤☆，ｘＵＡｎ—９００．。Ｄ咖ｆ知ｅ跏￡Ｐｍ Ｄｅｐ。ｎ一
５１０５１５，∞ｉ眦
，ｎｅ，ｌｆ，№咖ｎｇ舶印妇Ｚ，ｓｏｍｋｍ胍ｄ缸口ｆ踟眺珊毋，Ｇ懈ｎｇ抗ｏｕ
１．２纳入及剔除标准糖尿病组纳入标准参考１９９９ 年ｗＨ０的诊断标准，确诊为２型糖尿病患者并排除特 殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。对照组纳人健康人， 并排除急慢性肝胆及其他消化道疾病，常规检查无异 常者。研究对象采样前１个月内未使用抗生素，近２ 周内无服用益生元、益生菌等制品；近１个月内无腹 泻、便秘、痢疾等胃肠道疾病。
２结果
２．１
ｐＬ、上下游引物各１斗Ｌ、模板ＤＮＡ
Hale Waihona Puke ５斗Ｌ、ｄｄＨ２０ ３ｍｉｎ
斗Ｌ。反应条件为：（１）预变性：９５℃５
７２℃３０
１个循环；
（２）扩增：变性９５℃１０ ｓ、退火温度（表１）２０ ｓ、延伸
两组肠道菌属数量比较
两组肠道细菌总量极
ｓ共４５个循环。反应完毕后进行熔解曲线分
为相似，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。与对照组比 较，糖尿病组大肠杆菌属数量轻度增加，球形梭菌类 群、乳酸杆菌属数量轻度减少，但差异均无统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。糖尿病组柔嫩梭菌类群、双歧杆菌属、肠 球菌属数量显著高于对照组（Ｐ＜０．００５），拟杆菌属数 量显著低于对照组（Ｐ＝Ｏ．００７）。见表２。
・２００６・
广东医学２０１３年７月第３４卷第１３期
Ｇｕ柚ｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｍａｌ
Ｊｕｌ．２叭３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１３
２型糖尿患者肠道菌群特征分析
江美玲１，许岸高２△
。南方医科大学南方医院消化内科（广州５１０５１５）；２广东省惠州市医学研究所（５１６（）【）３） 【摘要】 目的分析２型糖尿病患者与健康志愿者间肠道茵群的差异，分析肠道菌群与空腹血糖之间的关
系，探讨肠道细菌在２型糖尿病发生、发展中可能发挥的作用。方法纳入５５例２型糖尿病患者（糖尿病组）及 ５７例健康志愿者（对照组），对其粪便提取基因组ＤＮＡ，应用茵属１６ｓｒＲＮＡ Ｖ３序列特异性引物，进行实时荧光定 量ＰｃＲ分析。结果糖尿病组与对照组肠道细菌总数、球形梭茵类群数量、乳酸杆菌属数量、大肠杆菌菌属数量 差异无统计学意义（ＪＰ＝０．５８６、尸＝０．３９４、Ｐ＝ｏ．６１１、ＪＰ＝０．２７０）；糖尿病组柔嫩梭菌类群、双歧杆菌属、肠球菌属数 量较对照组显著增加（Ｐ＜０．０１），拟杆茵属数量较对照组显著减少（Ｐ＝０．００７）。糖尿病组与对照组之间双歧杆 菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌属占总细菌比例差异无统计学意义（ＪＰ＝０．０９４、Ｐ＝０．６４２、Ｐ＝０．２３１）；糖尿病组柔嫩 梭菌类群、肠球菌属占总细菌比例较对照组显著增加（Ｐ＝０．００５、尸＝０．０００），拟杆菌属／球形梭茵占总细菌比例较 对照组显著性减少（Ｐ＝０．０１９）。空腹血糖与肠球菌属数量（ｒ＝Ｏ．２２１、Ｐ＝０．０１９）、肠球菌属占总细菌比例（ｒ＝ ０．２１３、Ｐ＝Ｏ．０１３）呈正相关，与拟杆菌属数量（ｒ＝～０．２４６、Ｐ＝０．００９）、拟杆菌属／球形梭茵占总细菌比例（ｒ＝一 ０．２０２、Ｐ＝０．０３３）呈负相关。结论２型糖尿病患者肠道内存在茵群失调；应用微生态制剂调节糖尿病患者肠道 菌群构成、改善血糖情况，未来可能作为控制２型糖尿病病情、改善预后的一种新治疗策略。
表ｌ引物信息
１．３．４
实时荧光定量ＰｃＲ将质粒标准品连续１０倍
１．４统计学方法应用ｓＰｓＳ １３．０统计软件，正态分 布资料以孟±ｓ表示，两样本间比较采用￡检验。不服 从正态分布资料用Ｍ（Ｐ。，Ｐ，，）表示，两样本的比较采
用Ｍａｎｎ—ｗｈｉｔｎｅｙ
稀释，获得１０１～１０ ７系列拷贝数的标准品作为模板，构
Ｃｏ玎唧ｏ，以抽ｇ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｏｂｊｅｃ６ｖｅ
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ａｓｓｅｓｓ
ｏＭ＃危ｏｒ：ＸＵ Ａｎ—ｇ∞．Ｅ一，ｎｎ甜：ｎ，ｌｇⅡ０６２＠２１ｃｎ．ｃｏｍ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｍｂｉｏｔａ ｉｎ ｔｙｐｅ ２
０．０８）ｍｍｏＬ／Ｌ。
便后２ ｈ内收集在密闭的粪便储存盒内，将上述标本 迅速储存于一８０℃低温冰箱中。 １．３．２粪便基因组提取将粪便标本放在冰上解冻， 按ＴＩＡＮａｍｐ
Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ
Ｋｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮ）产品说明书，每
例粪便称取２００ ｍｇ，提取粪便基因组ＤＮＡ，置于 一２０℃冰箱保存。
１．３．３
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１），ｗｈｉｌｅ
ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｐ＝０．０７）ｉｎ
Ｔ２ＤＭ ｐａｔｉｅｎｔｓ．
Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｂｉｎｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｐｏｎｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ
△通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ａ“ｇａ０６２＠２ｌｃｎ．ｃｏｍ
低水平炎症反应为特征…，而肠道菌群与宿主间在调 节能量平衡、炎症反应方面存在着密切联系。２１，因此人 们推测肠道菌群和肥胖、２型糖尿病等代谢性疾病的 发生发展密切相关。本研究拟观察２型糖尿病患者与 健康志愿者间肠道菌群的差异，分析肠道菌群与空腹 血糖之间的关系，探讨肠道细菌在２型糖尿病的发生、 发展中可能发挥的作用。
ｓｐｅｃｔｉｖｄｙ），ａｓ
ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ／Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｐｍｐｏｒｔｉｏｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｐ：０．０１ ９）．
Ｅｎｔｅｍｃｏｃｃｕｓ ｃｏｕｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｎｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｍｃａｎｔｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍａ
表２两组各肠道菌属数量比较［Ｍ（ｐ２５，Ｐ”）］ｌｇ ｃ叩ｉｅｓ／ｇ粪便
道菌群构成。由于在某些样本中，球形梭菌类群和拟 杆菌菌属数量超过总细菌数量，可能是由于扩增总细 菌的通用引物特异性并不足以代表整个肠道菌群，而 造成得到的总细菌数量偏低，或是用于扩增拟杆菌属 和球形梭菌属的引物特异性较差，目的片段的扩增中 也混有其他的细菌。为了克服这一缺陷，比较球形梭 菌类群和拟杆菌属占总细菌比例时，采用拟杆菌属／球 形梭菌进行比较。结果发现两类人群中肠道细菌总 数、球形梭菌类群数量存在差异，柔嫩梭菌类群数量在 ２型糖尿病患者中显著增加，而拟杆菌属数量显著降 低，且拟杆菌属数量及拟杆菌属／球形梭菌随着空腹血 糖升高显著降低。根据既往分析发现，瘦人消化道里 的细菌主要属于拟杆菌，胖人体内的拟杆菌比瘦人少 一半，而厚壁菌更多。厚壁菌能够从食物中“榨取”的 能量远远多于拟杆菌属，且减肥后患者拟杆菌数量增 加而厚壁菌数量减少。且近来的进一步研究显示，拟 杆菌能利用来源于食物颗粒、肠黏液层或是脱落的肠 道上皮细胞，根据食物环境的多糖及单糖的变化，调节 其基因组编码的大量糖基水解酶、糖代谢过程酶，帮助 宿主有效利用食物多糖，接种多形拟杆菌还可导致无 菌动物回肠中葡萄糖共运输蛋白的水平升高，这使得 即使在相同肠内葡萄糖含量情况下定植多形拟杆菌， 可加快葡萄糖从肠道运往其他需要之处，更有利于宿 主正常机能的完成，因而推测拟杆菌在的病理生理中 应有一定的作用¨“。虽然本研究与Ｌ～ＲｓＥＮ等¨６’的 拟杆菌属数量减少，代谢性内毒素血症水平、炎症反应 程度明显改善存在矛盾，但是与ｗｕ等‘１７。１圳针对中国 ２型糖尿病人群的研究得出的结果是一致的。考虑可 能是肠道菌群的构成在极大程度上受到饮食习惯和人 种基因的影响，东西方人种基因遗传背景、饮食习惯差 异造成这一相悖的研究结果。 随着研究的进一步深入，在大量关于肥胖、２型糖 尿病的动物和人体研究中，人们发现补充益生菌、益生 元制剂后，肥胖、２型糖尿病患者胰岛素抵抗、代谢性 内毒素血症、系统性炎症反应状态得到显著改 善２０。２川。因此笔者也将双歧杆菌属、乳酸杆菌属等常 见有益菌纳入研究的范畴，发现２型糖尿病人群中乳 酸杆菌属含量和比例轻度低于健康人群，并没有表现 出之前ｃＡＮＩ等。２２。在２型糖尿病小鼠动物模型、ＬＡＲｓ— ＥＮ等¨钊和ｓＡＮＴＡｃＲｕｚ等¨“”１在２型糖尿病以及肥 胖患者中所发现的乳酸杆菌属比例随着血糖升高明显 降低的情况。值得注意的是本研究发现在２型糖尿病 患者双歧杆菌属含量显著高于对照人群，但是与空腹 ｆｆ｝【糖不存在显著相关关系。这与ｗｕ等Ⅲ。和黄旭东 等。”一研究结果是相反的，考虑可能存在以下几个因 素：（１）ｗｕ等Ⅲ１的研究中仅纳入１６例２型糖尿病患 者、１２例健康人群，属于小样本研究，本研究的样本含 量为该研究的近３倍，扩大样本后，研究结果的趋势发