法。
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性

蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。


亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。

因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
2、盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（ 2 ）破坏水化膜，暴露出憎水区域， 由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。 白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
饱和度的概念：
以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度 是767g/L定义为100%饱和度。
目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸
铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。
对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度
都小于 0.l mg／L，通常为兼顾收率与纯度， 饱和度的操作范围在40%-80%之间。
5、沉淀法的步骤
① 首先加入沉淀剂; ② 沉淀剂的沉化，促进粒子生长； ③ 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、 收率和沉淀物的形状都有很大影响。
6、沉淀法的应用
沉淀法不仅可以用于实验室中；
也可广泛用于生产的制备过程。
因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生
物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方
pH值
两种蛋白质的相对溶解 度会随pH而变化很大；
等电点附近有极小值
pH
PH
pH值
在进行盐折时，必 须控制pH 图中直线都相互平 行
Ks β
பைடு நூலகம்
2）温度的影响
在低离子强度或纯水中，蛋白
质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。 但在高盐浓度下，蛋白质、酶 和多肽类物质的溶解度随温度 上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在0-4℃进行。 β随温度升高减小 Ks不随温度而变
缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应 该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶 解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放臵一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢， 一般可用超滤
则上式成为
（用浓度代替离子强度）
lgS= β－Ｋs m

(
式中m为盐的摩尔浓度.
8、用盐析法分离蛋白质的二种方法
盐析法分为两类， 第一类叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改 变pH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及 温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度 小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化 和结晶； 第二种叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改 变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓 度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感， 易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。
3）蛋白质浓度
沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度 有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会 发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作 用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一 点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
12、盐析法特点
1. 2.
3.
4.
成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。
四、等电点沉淀法
isoelectric point precipitation
第二章
沉淀法
通过本章学习应掌握以下内容
1. 什么是沉淀法？ 2. 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？
3. 常用的沉淀方法包括哪些？
4. 何谓盐析？其原理是什么？ 5. 常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？ 6. 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 7. 影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？
8. 等电点沉淀的原理是什么？
每一段盐析静置之后都要离心获得沉淀，透析并检测活
性。
比如实验中的活性物质主要在60%-80%盐析出来，在以后 的实验中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段 沉淀物可以抛弃（去除大多数杂质）；然后进行60%80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物含有大量目的蛋白质， 将其收集进行下一步纯化工作。
9、盐析用盐量的确定---饱和度
3、沉淀法的原理
生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就
是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都 会破坏溶液的稳定性。
沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，
控制溶液中各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的
溶解度不同而达到分离的目的。
溶剂组分的改变、改变溶液的pH值、离子强度和极性都会
蛋白质溶解度与盐浓度的关系Cohn经验式
㏒ S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度 I=1/2∑mizi2 ,mi—离子 i的摩尔浓度；Zi—所带电荷 β—常数，与温度、pH和蛋白质种类有关，与盐的种类无 关； Ks—盐析常数，与温度和pH无关，但与蛋白质和盐的种类 有关。

有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，
一、概述
1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀的过程。 2、沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成 分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前 仍广泛应用在工业上和实验室中。
5、盐析常用的盐
盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉 ；
（2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；
（4） 不易引起蛋白质变性。
6、盐析操作(加盐方式）
硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情 况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入， 并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
4、盐析用盐选择原则

盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱。 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ 阴离子的影响大于阳离子
使溶质的溶解度产生明显的改变。
4、沉淀法的操作


沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀 物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
（ 3 ）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋