第四部分分子生物学在系统学中的运用分子系统学(molecular systematics)是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及其演化规律的学科，是一门综合性很强的交叉学科。

其理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、比较生物化学、分子生物学和进化论，其方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学。

它是随着PCR技术、限制性内切酶等现代生物学技术的诞生及其在系统学中的应用和发展而形成的，经过几十年的发展，分子系统学逐渐形成了自身的原理和分析方法。

实验1 实验数据的获取进入NCBI主页(/)后，在Search框中选择nucleotide，在For后输入Grylloidea complete mitochondrion，即蟋蟀总科全线粒体后，点击Go即可搜索出符合条件的序列。

在搜索结果中浏览已经测序的蟋蟀总科全线粒体基因组，发现该总科已经被测序的有5种。

点开每一种的序列号，即可得到全线粒体基因序列及相关信息。

本研究所选择的5种蟋蟀总科及外群全线粒体基因序列数据的分类地位及来源见表2-1。

所用线粒体基因组主要来自于截止2012年3月为止GeneBank中收录的所用蟋蟀总科昆虫。

以NCBI中收录的东方蝼蛄(Gryllotalpa orietalis)和斑蝼蛄（Gryllotalpa pluvialis）作为外群。

实验2实验数据处理和分析所下载的5种昆虫的全线粒体基因序列所编码的基因完全相同，均为ATP6,ATP8,COX1,COX2,COX3,CYTb,ND1,ND2,ND3,ND4L,ND4,ND5,ND6基因。

将表2-1中所列的线粒体基因组编码的13个蛋白编码基因以及其联合数据分别作为一个独立的Fasta格式文件。

用ClustalX1.83进行多重序列比对，参数设置均设置默认。

将比对好的13种蛋白编码基因及联合数据集分别建成14个数据集。

(1) 序列组成分析经ClustalX 1.83软件比对后的序列为aln格式，在MEGA中打开并转化为meg格式，在使用MEGA 4.1软件进行比对结果的分析。

计算各个种之间的遗传距离(及其标准差)，各数据组碱基的组成(nucleotide composition)、保守位点(conserved sites)、变异位点(variable sites)、简约信息位点(parsimony information sites)、自裔位点(singleton sites)、两两碱基频率(nucleotide pair frequency)、转换与颠换的比值R(Ts/Tv)等。

并进行碱基组成偏向性分析和碱基替换饱和性分析等。

所有进化模型均假设各支系的碱基组成处于平衡状态，所以在数据分析之前，需要对数据组的碱基组成偏向性(base composition bias)进行检验。

(2) 数据组系统发育信号检测如果转换颠换比的值小于2.0此基因序列的突变已达到饱和状态，可能会发生多重替换，受进化噪音影响的可能性较大，给系统发育分析带来困难，因此要对各数据集进行碱基替换饱和分析。

实验3 系统发育分析软件分子生物之形质资料与一般传统形态形质资料之性质不同，故在计算生物间的相似度的方法或系数种类亦不同，特别需考虑sequence alignment的问题，而并非单纯或直接去比对各形质之异同。

1. ClustalX2.0：用来对核酸与蛋白序列进行多序列比较（multiple sequence alignment）的软件。

多序列比较在分子生物学中是一个基本方法，用来发现特征序列，进行蛋白分类，证明序列间的同源性，帮助预测新序列二级结构与三级结构，确定PCR引物，以及在分子进化分析方面均有很大帮助。

2. PHYLIP（Ver.3.68）：Phylogeny Inference Package，内含三十余种独立程序可分析各种类型之资料及选用不同的分析方法。

它可以分析DNA与蛋白序列，限制位点等，并可绘制进化树。

程序含有许多选项可以精确控制与分析。

3. TreeView 1.6.6：TreeView是用来生成与打印进化树的软件它可以读取NEXUS与PHYLIP生成的进化树格式文件，生成进化树，并输出到打印机。

4. PAUP 4.0b（Win）：PAUP是由Swofford所编写的利用简约分析进行系统发育分析（phylogenetic analysis using parsimony）的软件包，目前亦有多个版本。

该软件包中提供了简约分析用的多种模型，其中包括了Wangner、Fitch、Doll、Camin-Sokal等，对系统发育分析结果亦可进行一些统计分析及自举检验。

PAUP具有IBM-PC和Macintosh两种文本供选择。

5. MEGA 4.1：分子进化遗传分析MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）是由Kumar等（1993）所编写的分子进化遗传分析的软件包。

在版本4.1中，它能对DNA、mRNA、氨基酸序列及遗传距离进行系统发育分析。

在建树方法上，提供了目前最常用的UPGMA、邻近法及最大简约法，对所获得数亦可进行自举检验及标准误估计可靠性检验。

6. MrBayes (Version 3.1.2)：MrBayes软件可进行贝叶斯系统发育推论分析，其网址为http://morphbank.ebc.uu.se/mrbayes，目前可以免费下载。

该软件以NEXUS格式输入数据，但如果数据为隔行，则必须加入interleave=yes。

数据可以是核酸或氨基酸序列，也可以是限制性位点或以0、1表示的形态数据。

可以通过批处理或逐步执行的程序。

MrBayes软件可以通过不同的方法汇总模型参数的后置分布，包括系统树布局和分支长度，该软件还可以推导祖征和位点速率。

实验4 系统发育树构建1 距离矩阵法(distance-matrix methods)距离法矩阵是指以距离系数矩阵为基础的各种系统发育分析方法。

这类方法首先要求原始数据以成对分类单元之间的距离形式表示，对于性状数据编码后要转换成距离数据。

当距离关系满足超度量特性时，可以直接应用聚类分析方法构建超度量树，否则就要用叠加树法。

这类方法的优点是算法较性状数据分析方法简单直观，对进化过程没有其它更多的假设，故系统分析的结果具有稳定性。

基于距离构建系统树的方法很多，其中被证明能有效用于实际数据分析的方法有算数平均的不加权的组队法(UPGMA)、最小进化法(ME)和邻接法(NJ)。

2 简约性方法(parsimony methods)简约性方法源于形态性状研究，该方法的理论基础是ockham的哲学原理，即解释一个过程的最好的理论是所需假设数目最少的那一个。

如果对系统发育推断所需要知道的进化愈少，结果就愈可信。

与其他方法比较，简约法依靠较少或简单的进化假设，可以直接利用原始数据，不需要将原始数据转换成距离数据，可以避免信息丢失，而且大多数简约法的计算机算法及程序比其它方法更成熟。

该方法既可以用于核昔酸数据，也可以用于氨基酸数据。

简约性方法中最常用的为MP法(maximum parsimony，最简约法)。

简约法是一种不依赖任何进化模型的方法，能快速地分析出大量序列之间的系统发生关系，所构建的树中的短分支更接近真实，但简约树的树长值完全决定于所有重建祖先序列中的最小突变数，而突变是否按照事先约定的核昔酸最少替代的途径进行是不得而知的，单一的突变图谱可能会得出似是而非的结论。

再者，所有分支的突变数不可能相同，由于没有考虑核昔酸的突变过程，使得长分支末端的序列由于趋同进化而显示较高的相似性。

趋同现象违背了简约法则，导致的结果是对“长支吸引”的敏感。

因此，当序列单位位点上核昔酸替代数相对较大时，则极可能得出错误拓扑结构的树。

3 最大似然法(maximum likelihood method，ML法)最大似然法是应用统计推断构建系统发育关系的典型方法。

其原理是，只要建立一个关于进化过程的模型和一组观测数据就可以进行统计推测，一棵树(T)的似然性(L)是产生该树的观测数据(D)与进化模型(M)的概率。

在给定D和H的条件下，不同分枝形式和分枝长度的树有不同的似然性数值，极似然法的标准是选择具有最大似然值的树。

其分析的核心在于替代模型，目前根据碱基频率的相等或不等、转换和颠换速率的相等或不等、位点间替换速率异质性的有无以及不变位点比例的高低等特征提出的替代模型很多，仅在Modeltest软件中实际使的就达到56种，模型的正确选择也就成为极似然法的关键所在。

似然法似乎是几种常用方法中最为接近序列实际进化的方法，它考虑了所有可能的突变路径，能完全利用数据的系统发生信息。

然而，极似然法构建的系统树在很大程度上依赖于对核昔酸替代模型的选择。

似然法运算强度极大，对于分类单元较多时十分费时，这也是似然法应用的最大障碍。

而且似然法并没有评估拓扑结构的优劣，而是假定分支长度估计最精确的拓扑结构为最优树。

实际上，系统发生所关心的是树的拓扑结构，分支长度反而成为干扰参数,忽略分支长度似乎更合理些。

4 贝叶斯推论法(Bayesianinference)贝叶斯推论法是建立在后验概率(posterior probablity)基础上的，有关类群历史的推断是根据树的后验概率进行的，具有最高后验概率值的树的分支格局就可以作为有关类群系统发育关系的最佳估计。

一系列数值方法可以用于近似的获得后验概率，其中最有用的是Markov链Monte Carlo。

算法，其基本思想是建立Markov链，以替代模型参数作为状态空间，其静态分布就是参数的后验概率分布，通过计算机模拟和抽样技术获得分支格局的后验概率。

贝叶斯推论的优点在于能够以很高的计算速度处理大型数据集，同时提供了衡量树可信性的有效参数一后验概率。

贝叶斯法和极似然法相似，都是选定一个进化模型，然后通过程序搜索模型和序列数据一致的最优系统树。

但二者基本的不同在于，似然法是以观察数据的最大概率来拟合系统树。

贝叶斯法正好相反，是通过系统树对数据及进化模型的最大拟合概率而得到系统树。

极似然法给出的是数据的概率，而贝叶斯法给出了模型的概率。

极似然法搜索单一的最相似系统树，贝叶斯法得到的是具有大致相等似然值的系统树集合。

所有系统树的后验概率加在一起等于1，任何分支上的后验概率就是所有系统树该分支的后验概率之和。

将所有系统树按照后验概率大小排列，然后将具有最大后验概率的系统树加在一起，直至后验概率大于0.95通常，在此95%置信概率，贝叶斯法会给出唯一的系统树。