（一）基因组DNA提取上海博彩生物科技有限公司：3S DNA Isolation Kit for Environmental Samples V2.2 3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2DNA抽提方法使用仪器：灭菌锅，无菌操作台，移液枪，漩涡振荡器，台式离心机，水浴锅，分光光度计或者琼脂糖电泳槽灭菌物品：枪头，1.5ml，2ml离心管一、污泥样品前处理样品在处理前首先要混匀，使其中的悬浮物质分布均匀。

取约l0mL污水样品，加入灭菌离心管，400Orpm、离心20min，收集沉淀，加约4倍体积的TENP buffer(50mMTirs，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mL PVP，pHl0)，加玻璃珠(d:l mm)充分匀化(解絮凝)。

4000rpm，离心20min，弃上清(重复两次，直至上清液较澄清)。

加约4倍体积的PBS buffer(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于lL 水、pH7.4)，旋涡混匀，4000rpm，离心20min，收集沉淀(重复两次)二、基因组DNA提取1.样品准备：100mg样品用200ul Solution SUS 将样品浸泡、悬浮，使样品软化分散开。

2.加入400ul Solution L YS，300mg石英砂，盖上离心管盖，在漩涡振荡器上高速剧烈振荡，10-30min或更长时间。

3.用台式离心机，12000rpm，室温离心5min。

4.将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中，加入120ul Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀。

将溶液用1ml TIP全部转移到3S柱内，柱子放入2ml离心管中，不盖离心管盖，室温放置2min以上。

5.盖上离心管盖，12000rpm，室温离心1min。

6.取下3S柱，弃去离心管中的废液。

将柱子放回同一根离心管中，加入600ul Wash Solution，10000rpm，室温离心1min。

7.重复6一次。

8.取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。

将柱子放回同一根离心管中，10000rpm，室温离心2min，以除去残留的Wash Solution。

9.洗脱：在柱子中央加入100ul TE，将柱子放入新的干净1.5ml离心管中，室温放置2min。

12000rpm，室温离心1min。

收集管中的液体即为基因组DNA。

根据用途，样品可以4℃或-20℃保存。

为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55℃。

如果样品中基因组DNA含量很低，用30ul TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。

重复该洗脱步骤一次，可以提高产率20%左右。

三、提取DNA的质量检测(1)DNA纯度和浓度检测用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230，260，280nm处的吸光光度值。

DNA纯度的定性检测:通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。

通常纯DNA样品A26O/A280≈1.8，A260/A230>2。

若A260/A280>l.9，可能有RNA污染；若A260/A280<l.6，可能有蛋白质污染；若A260/A230≤2，可能存在酚类等小分子杂质。

DNA浓度的计算：浓度(µg/mL)=A260*50*稀释倍数；注：1OD值相当于50 µg/mL双螺旋DNA。

(2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳lh，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。

（二）PCR扩增一、PCR扩增引物采用两组对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对：组合(F34，GC和RS:8)。

引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡结构。

它们各自序列分别为:F341:(5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’)，Rsls:(5’一ATTACCGCGGCTGCTGG一3，)，GC发卡结构(5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3’)。

引物组合扩增产物片段长度约为220bp。

二、PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系，与表3一3相同。

加样后立即进行PCR扩增。

三、PCR扩增程序PCR扩增程序，与表3一4相同。

四、PCR产物电泳检测取5闪PCR产物进行电泳，胶浓度为2.0%，在电压100v条件下电泳lh后检测，经EB染色后用凝胶成像系统观察，保存凝胶图谱。

电泳所用Marker为天根生化科技(北京)有限公司生产的nNAM叭e:nLZo00。

（三）变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析预电泳的作用1.使体系达到反应的条件2.清除过多的变性剂和APS等，保持胶的稳定状态。

聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。

其装载的样品量大，回收DNA纯度高。

长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。

一、试剂配制(l)50*TAE缓冲液:242g Tris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。

混合均匀后高压灭菌20-30min，室温保存。

(2)40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5：1)：38.93g丙烯酰胺，1.07g双丙烯酰胺，加水至100mL。

(3)O%变性溶液：20mL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，加水至100mL，再分别加入80µL APS和5µL TEMED。

4℃条件下保存在棕色瓶中。

(4)100%变性溶液：2OmL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，40mL甲酰胺，42g尿素，加水至100mL，再分别加入80µL APS和5µL TEMED。

4℃条件下保存在棕色瓶中，100%变性溶液在使用之前需要预先溶解，把瓶子放进水浴锅中加温并快速搅拌。

(5)10%过硫酞胺(APS)：lg过硫酰胺加水至10mL。

现用现配。

(6)对于变性浓度低于100%的溶液，用0%和100%的变性溶液混合配制而成，尿素和甲酰胺含量如下所示：不同浓度的变性溶液尿素、甲酰胺含量二、DGGE胶的制备(l)用无水乙醇清洁制胶用的两块玻璃板，将spacer放在2个玻璃板之间，插入clamp中，将aligment板放入，用螺丝夹子固定，将aligment取出，用手摸底部是否平整，要绝对的平，否则会漏。

(2)将软垫放在底座上，玻璃板放在软垫上固定，用水平器调节。

(3)配制13.5mL高浓度变性梯度液，加入梯度仪高浓度右槽，打开左槽螺旋，溶液流入左槽，关上螺旋，用吸管将它们吸回右槽内(确保两槽无气泡阻隔)。

(4)配制13.5mL低浓度变性梯度液，加入梯度仪低浓度左槽。

(5)轻轻打开两槽间的活塞和梯度仪出口开关，并搅拌。

将长针头插入玻璃板之间，流速保持在2mL/min左右。

(6)胶板灌满后，顶部插入梳子，凝固2小时。

三、DGGE凝胶电泳步骤及染色(l)在DGGE槽中加7L左右1*TAE(DGGE专用)，使槽中的水至Full和Run的中间位置；加盖，注意长杆进入底部的窟窿中，打开电源，将温度设置到60℃，打开heat键。

(2)当梳子位置的胶凝固好后，将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上，如果只有1板胶，注意另一侧也要固定玻璃板(不加spacer)，否则漏水。

安装好玻璃板后，将凝胶板架(红点在右边)放入水槽中，之后将温度控制器盖在电泳槽上，注意长杆进入底部的窟窿中。

打开电源，打开heat键和bump键，开bump键后，水位会下降，降至run与maxmum的中间，水若不够的话，关闭电源，打开温度控制器上方的探望口，加1*TAE补足。

(3)温度达到60℃，立即进样，先关掉所有电源，取下温度控制器，小心地拔掉梳子，用移液枪冲洗侮一个进样孔；进样要缓慢，使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。

每一个进样孔加入25µL样品。

(4)将温度控制器盖在电泳槽上，打开电源，将温度调到60℃，打开heat键和bump键，运行5min后，在主机上插入红黑电源线，注意红黑线不要颠倒。

打开主机电源，将电压调到120V，时间调为5h。

(5)电泳结束后，关掉电源，打开盖子，将凝胶板架拿出，控水，卸下玻璃板。

将clamp卸下，手抓住spacer，向内侧拧，揭下短玻璃板，胶粘在长玻璃板上。

(6)将托盘上平铺张保鲜膜后，将长板和胶放入托盘中银染。

银染步骤步骤：时间溶液固定30 min 10%冰醋酸、30%乙醇，100 ml敏化2*10 min 30%乙醇，100 ml洗涤冲洗30 s，漂洗5*5 min 双蒸水银染30 min 新鲜配制的0.1%AgNO3，100 ml，使用前加入370 μl的福尔马林溶液洗涤冲洗30 s，漂洗1 min，再冲洗30 s 双蒸水显影直至显示条带为止，密切观察溶液1：0.2 g硫代硫酸钠于10 ml水中溶液2：2.5 g碳酸钠于100 ml水中将100 μl溶液1加入溶液2中，再加350μl的福尔马林溶液终止30 min 5.84 g EDTA2Na·2H2O以及8 g Glycine于双蒸水中，定容至400 ml（也可用10%的冰醋酸）保存长达数日10%甘油长时间保存干胶自然干燥即可（1）AgNO3母液（20%）：将2 g AgNO3溶解于双蒸水中，定容至10 ml，放置于棕色瓶中密闭保存。

每次使用时取2 ml母液，稀释至400 ml，再加入福尔马林。

（2）10*Tris EDTA（TE）：pH=8.0A．100mmol/L Tris-CI（pH=8.0）B．10mmol/L EDTA (pH=8.0)C．Tris-Cl(1 mol/L)：用800 ml蒸馏水溶解121.1 gTris碱，加浓盐酸调pH值至所需值。

银染原理：银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。

虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。

如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。

为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。

简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。

银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。