分子克隆实验常见问题与解决方案
黄荣桂
Fermentas China
Experience
Fermentas 总部的技术支持经常接到克隆实验相关 问题的咨询（5-6例/周）
我今天和大家介绍:
最常规的一些问题 / 原因 / 解决方案
时间安排
一个经典的克隆实验一般不会超出 2-3 天的时间
Day 1: 准备载体 & 插入子 Æ 连接 Æ 转化
样品和DNA marker保持用同样的loading buffer. 采用大小相似的条带来比较分析待测条带 如果可能，保持待测样品的上样量与所选DNA marker大致
相同。
克隆流程
准备载体和待插入的DNA
- 内切酶消化PCR产物或者质粒 - DNA 末端修饰
- 胶回收 - DNA 浓度的估算
Æ page 172 catalogue (2010/11)
pUC19 多克隆位点
Green – 同时酶切 Blue – 先切 Red – 后切
Restriction digestion: Plasmid DNA
问题: 没有或者仅仅只有部分酶切
原因: 酶的功效被甲基化封闭或者减弱了
XbaI
E.coli cells
20 – 100 ng
与载体1:1 to 1:5（摩尔比）
2 µl
2 µl 粘性末端 1u 平末端 5u 至 20 µl
孵育 10 min - 1h， 22°C（RT) 50ul 化学感受态细胞加入5 μl连接混合物 50ul 电感受态细胞加入1-2 μl连接混合物
Fermentas提供的连接酶 均带有单独包装的PEG
克隆效率根据未经紫外光照射的puc19质粒DNA的效率计算而来
DNA Quantification on a Gel
如何在凝胶上对DNA进行定量分析: MassRulerTM Express DNA Ladder Mixes
DNA Quantification on a Gel
如何在凝胶上对DNA进行定量分析:
Star activity
FastDigest® poster
Is posterio apie star activity
克隆流程
准备载体和待插入的DNA
- 内切酶消化PCR产物或者质粒 - DNA 末端修饰
- 胶回收 - DNA 浓度的估算
连接
- 建立体系 - 对照反应
转化
- 对照反应
Focus - Restriction Digestion 问题: 星活性 (relaxation of specificity)
EcoRI:
GAATTC
Star activity: T A A T T C GAATTC NAATTN
Lambda DNA + EcoRI
星活性的定义：限制酶在一些特定条件下 使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。 即可以把与原来识别的特定的DNA序列不 同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Focus - Restriction Digestion
问题: 星活性
解决方案
• 缩短孵育时间 • 不要加过量的酶
• 甘油浓度<5%(eg:Alw2II,BpiI,
Bsp68I etc对甘油敏感）
• 用纯度较高的 DNA
<25mM
• 选择合适的缓冲条件 用 FastDigest® enzymes
30 min 22°C (RT)
Focus - T4 DNA Ligase 问题: 无连接
原因: 储存不当 ¾ 冰箱温度低于-30°C. （低于 -30°C ，连接酶会开始结冰）
! 3次反复冻融后，连接酶的活性会显著降低 !
Focus - T4 DNA Ligase
问题: 无连接, ligase 有活性
Klenow Fragment: 补平 5’-突出端
(S1 Nuclease): 去掉 5’ 和 3’ 突出端
Do not use Klenow exo-
DNA End Modifications
问题: 磷酸化与去磷酸化
P
P SAP or FastAP™
PCR product
T4 PNK+ ATP
+ Polymerase: 5’ - GAATT- 3’ 3’ - CTTAA- 5’
2）酶切之后的短片段可能会在连接反应中，和插入子竞争载体，因此建 议酶切之后对PCR产物进行胶纯化处理，除去这些小分子DNA片段。
Restriction digestion: Plasmid DNA
问题: 多克隆酶切位点内的切割效率不高
/ Catalog (2010/11), page 171
16h*
Restriction digestion: PCR products
FastDigest® poster
Restriction digestion: PCR products
Day 2: 挑克隆 Æ 菌落PCR或者菌 液PCR检测阳性克隆Æ 分离 DNA Æ 限制酶消化或者测序分析
(Day 3: 从过夜培养的菌液中分离 DNA，并通过限制酶消化分析or测 序)
Final Goal
优化克隆流程可以让阳性克隆 >80%
选 5 克隆子 Æ 至少得到4个阳性克隆
克隆流程
准备载体和待插入的DNA
- 内切酶消化PCR产物或者质粒 - DNA 末端修饰
- 胶回收 - DNA 浓度的估算
连接
- 建立体系 - 对照反应
转化
- 对照反应
Restriction digestion: PCR products 问题: 切割效率低
每种限制性内切酶需要一定的保护碱基
12
Lambda DNA/Hind III DNA marker (#SM0101)
T4 DNA ligase
-+
连接:
0.5 µg Lambda DNA/Hind III fragments
1u T4 DNA Ligase 2µl 10x T4 DNA Ligase buffer 20µl final volume
Restriction digestion: Plasmid DNA
问题: 没有或者仅仅只有部分酶切
Reason: Enzyme is blocked or reduced in activity by Dam, Dcm, EcoKI or EcoBI methylation
方案:
使用不会甲基化质粒DNA的E. coli 菌株
原因: 反应混合液中含有T4 DNA Ligase的抑制剂
过量的盐离子 (>150 mM NaCl, >200mM KCl) EDTA, 蛋白, 氛, 乙醇 纯化柱上的硅胶基质 甘油 (在反应体系中不能 5%的浓度) dATP
Focus - T4 DNA Ligase Problem: No transformants, 连接酶有活性
+ P PCR product P
如果使用的是去磷酸化的载体，需确认插入子是否带有磷酸化末端
PCR 产物一般末端不带磷酸基团，需用T4 Polynucleotide Kinase （ T4多聚核苷酸激酶）磷酸化处理
Focus - Gel Extraction
问题: DNA 从胶上切下的时候，被紫外光损坏 解决方案:
Focus - Ligase Reaction 如何将载体插入子的摩尔比换算为ng？
实验例: 载体 = 6kb (20ng); 插入子 = 1kb; 载体: 插入子 = 1:3
20ng 载体 x 1kb 插入子 x 3 = 10ng 插入子
6kb 载体
1
Focus - Ligation Reaction 也可以通过 Fermentas的网络工具来计算
DNA 末端修饰
问题: 不能有效的完成DNA末端平滑化
选对DNA blunting enzyme 和方法
5'- NNN
5'- NNNNNNN - 3'
3'- NNNNNNN - 5'
3'- NNN X
5‘-overhang
3‘-overhang
酶:
T4 DNA Polymerase: 补平 5’-突出端, 去掉3’-突出端
连接
- 建立体系 - 对照反应
转化
- 对照反应
Focus - Ligation Reaction
连接反应例:
线性化载体 DNA 插入 DNA 10x T4 DNA Ligase Buffer PEG 4000 50% (用于平末端连接) T4 DNA Ligase
Water, nuclease-free
e.g.: GM2163 (可免费索取)
Genotype: F-ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm-6 hisG4 rfbD1 rpsL136 dam13::Tn9 xylA5 mtl-1 thi-1 mcrB1 hsdR2
/reviewer/app
Focus - Ligation Reaction
连接效率
可通过凝胶电泳进行分析 ¾ 用含有Loading 染料的SDS混合样品 ¾ 65°C，加热10 min，点样
1 2 3M
凝胶上的连接反应产物分析示例：
M - GeneRuler™ DNA Ladder Mix 1 –DNA 插入子和载体的混合溶液
使用较长波长的紫外光 (360 nm)