1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细
胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细 胞的增殖能力
克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠
细胞工程-动物细胞培养
2. 台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色， 用活细胞占细胞中的百分比表示细 胞活力
(1) 吸出培养瓶内旧培养液。 (2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 (3) 2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细
胞质回缩现象，终止消化。 (4) 吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以
免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 (5) 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。 （6）重新接种培养。
（2）加入2mg／ml的MTT液（50ul／孔）； 继续培养3小时。
（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液 （150ul／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上 振荡10分钟，使结晶物溶解。
（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长 570nm），记录结果，绘制生长曲线。
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（四）细胞冻存和复苏
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温 度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器
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3 四唑盐（MTT）比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干
水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞 中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜 （DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 再用酶标仪测定OD值
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建立细胞系的要求
国际上对Certified cell的确定尚无统一 标准 1 组织来源 2 细胞生物学检测：形态，特异结构， 细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特 异性如腺细胞，肿瘤细胞 3 培养条件和方法
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（三）细胞系和细胞株鉴定
鉴定指标：纯度，细胞学特性，稳定性， 污染情况 鉴定方法：细胞形态学观察，绘制生长 曲线，计算分裂指数，染色体组型和带 型分析，同工酶酶谱检测 档案资料及管理使用：美国标准细胞库 ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰 老细胞库CAR
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规 工作。细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减少污染， 减少细胞生物学特性变化。
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液氮罐
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Cryopreservation
How does freezing induce damage?
cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration
（1）原代培养与传代培养
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1 取材
取材部位是否准确 组织是否保持活性 材料处理是否恰当
Trypsin－EDTA collagenase
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2 原代培养——组织块培养
组织块的培养
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3 传代培养——消化法
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一般传代培养的步骤
2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含 青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培 养瓶中。
3） 于37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再 补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 养液，继续培养。
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（3）建系过程
组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向 外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可 以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长 开始明显加快，并向周围延伸。 用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维 细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁 生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周 后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长， 命名为ECA109。 ECA109 经生物学特性分析 后确定细胞系建立成功
transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth
Thawing rate is also important (thaw rapidly)
最适度以下的
最适度以上的
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细胞计数
四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左 线和上线边的细胞。 细胞密度个/ml＝平均细胞数x10^3x稀释倍数
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培养细胞活力测定
细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、活细胞是困难的。
MTT法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。
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操作步骤:
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103104 细胞/孔，每孔培养基总量200ul（96孔培养 板每孔容积370ul），37℃、5％CO2培养箱中培 养一段时间（根据实验目的决定培养时间）
动物细胞培养技术－2
细胞工程-动物细胞培养
（一）常用的培养方法
悬滴培养Hanging－drop cultivation 培养瓶培养 旋转管培养Rotate tube cultivation 克隆培养法Cloning culture technique 细胞同步化培养 动物细胞大规模培养
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（二）建立细胞养与建系过程
以人上皮型食管癌109细胞系的建立为 例介绍一下具体的建系过程：
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（1）取材
食管癌患者的手术标本
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（2）原代培养
1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小 时。