海蜇胶原蛋白肽的酶解制备工艺李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟【摘要】以海蜇加工下脚料为原料提取胶原蛋白,以还原力(RP)和水解度(DH)为指标,采用响应面法研究了酶解温度、酶解时间、pH、料液比、酶添加量对还原力和水解度的影响,得到最佳酶解胶原蛋白的工艺条件;并进一步与复合酶水解工艺进行比较,确定海蜇胶原蛋白肽的最优制备工艺.结果表明:胰蛋白酶的最优酶解条件为:温度44℃、pH8.5、料液比0.50 g/mL、酶添加量3.0％和酶解时间4h;风味蛋白酶的最优酶解条件为:温度44℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL、酶添加量4.0％和酶解时间4h;进一步进行复合酶实验,结果表明采用风味蛋白酶和胰蛋白酶分别在其最适条件下进行先后酶解获得的酶解液的DH和RP最高,分别为(71.56％±0.0076％)和(0.341±0.0101).%Taking jellyfish processing residues as rawmaterial,reducing power (RP)and degree of hydrolysis (DH)as indicators,the optimal digestion temperature,digestion time,pH,solid-liquid ratio,enzyme amount were analysed by response surface method according to the degree of hydrolysis of collagen.Then comparing with composite enzyme hydrolysis process,the optimum preparation technology of collagen was analysed.The result showed that temperature of 44 ℃,pH8.5,solid-liquid ratio of 0.50 g/mL,protease addition of3.0％,extraction time of 4 h and temperature of 44 ℃,pH7.5,solid-liquid ratio of 0.56 g/mL,protease addition of4.0％,extraction time of 4 h were determined as the optimal proteolysis conditions to prepare antioxidant peptides from jellyfish using trypsin and flavourzyme,respectively.The effects of multiple enzymes on DH and RP of the collagen peptide werefurther investigated.Sequential treatment of trypsin and flavourzyme under their optimal conditions on collagen led to peptide products with the highest values of DH(71.56％± 0.0076％)and RP(0.341 ± 0.0101).【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)007【总页数】9页(P132-139,145)【关键词】胶原蛋白;胶原蛋白肽;胰蛋白酶;风味蛋白酶;水解度;还原力【作者】李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟【作者单位】福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116;福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116;福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116;福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116【正文语种】中文【中图分类】TS254.9自由基的累积会造成机体严重损伤,与DNA损伤、心血管疾病、衰老和癌症等疾病息息相关。
早期对机体内自由基的清除多采用一些合成类抗氧化剂,如丁羟甲苯和叔丁基羟基茴香醚等。
但是由于这些合成类抗氧化剂对人体具有较强的毒副作用,我国政府已经限制了该类添加剂的用量。
因此寻找天然、高效且无毒副作用的新型抗氧化剂是近几年的研究热点。
一些研究表明,胶原蛋白肽对自由基具有良好的清除效果,是一种天然的抗氧化剂。
Li等[1]使用不同蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白,得到氨基酸序列为QGAR的抗氧化肽,具有较高的DPPH自由基清除能力、金属离子螯合能力和脂质过氧化抑制能力。
胶原蛋白肽拥有独特的氨基酸组成,拥有多种生理功能活性[2-3],如降血压、抗黑色素、免疫活性、促进钙吸收和抗关节炎等,具有广阔的应用前景。
目前制备胶原蛋白肽最常用的方法是酶解法,其工艺主要包括单酶酶解法[4]和复合酶酶解法[5]。
较为常用的提取用酶为胃蛋白酶[6]、中性蛋白酶[7]、碱性蛋白酶[8]和胰蛋白酶[9]等。
研究发现,单一酶作用范围较小,只能使小部分的蛋白降解;而选用复合酶法进行水解,可有效增大底物的水解程度,可以使得更多的活性氨基酸残基暴露出来[10]。
表1 不同蛋白酶的最适酶解条件Table 1 Optimal enzymatic conditions of different protease酶种类胃蛋白酶胰蛋白酶碱性蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶木瓜蛋白酶温度(℃)373750505050pH2.08.08.07.07.07.0本文以海蜇加工下脚料为原料提取胶原蛋白,在单因素实验的基础上,采用响应面法对海蜇胶原蛋白肽的单酶水解工艺进行优化,并进一步与复合酶水解工艺进行比较,确定海蜇胶原蛋白肽的最优制备工艺,为海蜇加工下脚料的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料与仪器海蜇加工下脚料已除盐的南蛰海蜇皮,海蜇体呈伞盖状,通体呈半透明,福建亿达食品有限公司;丙酮、碳酸氢二钠、Tris、浓盐酸(HCl)、福林试剂、谷胱甘肽、胃蛋白酶(1.58 U/mg)、胰蛋白酶(4.40 U/mg)、还原型谷胱甘肽国药集团;风味蛋白酶(7.62 U/mg)、木瓜蛋白酶(13.73 U/mg)、中性蛋白酶(9.02 U/mg)、碱性蛋白酶(84.63 U/mg) Solarbio公司;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)、马尿酸、Tyrosinase Sigma公司;DPPH Aladdin公司。
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1.2 实验方法1.2.1 海蜇胶原蛋白肽的提取将海蜇加工下脚料用清水冲洗,将除盐的海蜇用搅拌机搅碎20 min,过滤沥干;添加丙酮溶液没过海蜇,静置1 d,蒸馏水清洗至无异味,过滤沥干;置于0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液中浸泡三次,每3 h更换一次溶液,蒸馏水清洗至中性,过滤沥干,4 ℃冰箱存放备用。
取一定质量的海蜇皮匀浆,加入一定体积相应pH的缓冲液至一定料液比,添加一定比例的蛋白酶,置于一定温度酶解一定时间;待反应结束后,将酶解液置于沸水浴中加热10 min使蛋白酶失活,13000 r/min离心10 min,取上清多肽液进行水解度(DH)和还原力(RP)测定。
1.2.2 缓冲液体系 Phosphate缓冲体系:pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的缓冲液由0.1 mol/L的Na2HPO4·12H2O和0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。
Tris-HCl缓冲体系:pH(8.0、8.5、9.0)的缓冲液由0.1 mol/L的Tris和0.1 mol/L 的HCl配制而成。
1.2.3 蛋白酶的选择以DH和RP为指标,在酶添加量100 U/g、料液比1∶1(g/mL)和酶解时间4 h条件下,比较六种不同蛋白酶在其最适酶解条件(见表1)下对海蜇蛋白的酶解效果,并选用最适的两种蛋白酶用于下一步实验研究。
1.2.4 单因素实验1.2.4.1 温度对酶解效果的影响在酶添加量1.0%、酶解时间2 h、料液比1∶2 (g/mL)和pH7.0条件下,考察了不同温度(30、35、40、45、50、55 ℃)对胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解效果的影响,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.2 pH对酶解效果的影响在酶添加量1.0%、酶解时间2 h、料液比1∶2(g/mL)和温度45 ℃条件下,采用两种不同缓冲体系(Phosphate缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系)考察了不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解效果的影响,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.3 料液比对酶解效果的影响在酶添加量1.0%、酶解时间2 h、温度45 ℃和pH8.0(pH7.0)条件下,比较不同料液比[3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)]下胰蛋白酶(风味蛋白酶)的酶解效果,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.4 酶添加量对酶解效果的影响在料液比1∶1 (g/mL)、酶解时间2 h、温度45 ℃和pH8.0(pH7.0)条件下,比较了不同酶添加量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%)对胰蛋白酶(风味蛋白酶)酶解效果的影响,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.5 酶解时间对酶解效果的影响在酶添加量3.0%(酶添加量4.0%)、料液比1∶1 (g/mL)、温度45 ℃和pH8.0(pH7.0)条件下,测定不同酶解时间(2、3、4、5、6、7 h)下胰蛋白酶(风味蛋白酶)酶解液的DH和RP。
1.2.5 酶解胶原蛋白的响应曲面实验1.2.5.1 响应面实验设计在单因素实验的基础上,以DH和RP为响应值,以蛋白酶的酶解温度、pH和料液比作为自变量进行响应曲面实验,在Box-Behnken中心组合实验进行设计,确定海蜇蛋白单酶最优酶解工艺。