E
3.抗原或抗体的酶标记
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间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
稀释液
A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 稀释液
S1 一 抗 原 液
顺序(每孔 100ul)
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A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 稀释液
2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入100uL一抗， 再加100uL一抗到２号孔中，混匀，从２号孔吸取 100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸 取１００uL，丢弃！
环境卫生
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酶催化底物液显色
DH2+ H2O2
E
D+ 2H2O
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。

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酶 /E
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
病原微生物及其抗体检测如:肝炎病 毒,SARS等
蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿 瘤标记物
非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定
……
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ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
科研服务
……

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需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用

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结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅
待检样品孔显色明显 空白对照

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注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）
倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高 浓度方向进行
终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色 黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
测定波长
nm
492 450 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
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碱性磷酸酯酶 (AP) 葡萄糖氧化酶
(GOD)
β-Ｄ－半乳糖苷 酶 (β-Gal)

洗涤：3次， 1min/次
E
E
→
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
→
终止液终止显色
加酶标抗体：1:5000稀释 的HRP标记的驴抗兔IgG抗 血清， 37 ℃ ２0min
加底物液显色
每孔加１００ul!
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一 抗 试 管
倍比稀释法与加样
S
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。 根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。

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免 疫 荧 光 技 术 用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
课程内容
ELISA的原理
ELISA的分类
间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例

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ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化

ห้องสมุดไป่ตู้
鼠IgG(抗原)
免疫 兔抗小鼠IgG(一抗) Fc段 HRP-驴抗兔IgG(二抗)
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操作步骤
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔 37 ℃ 20min 抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
辣根过氧化物酶 (HRP)
底 物/DH2
邻苯二胺(OPD) 四甲替联苯胺(TMB) 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和 制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
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（四）竞争法（HBcAb ）
HBcAb HBcAg 酶标HBcAb
TMB wash wash
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb； 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不 能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药 物等ELISA测定多用此法。
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其优点在于只要 变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗 体的方法。可用于 传染病的诊断。
一抗
Ag
酶标二抗
BSA wash wash wash
TMB

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（三）双抗体夹心法（测抗原）
包被Ab
Ag
酶标Ab TMB
wash
wash
wash
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
免疫学教研室
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
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免 疫 荧 光 技 术
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ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法

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（二）间接法（测抗体）
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗 体以检测已与固相 结合的受检抗体， 故称为间接法。