操作步骤
每种液体均加100ul
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 37 ℃ 30min
加待检抗体：倍比稀释的兔抗 鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
E
E
→
洗涤：3次， 1min/次
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
E
D+ 2H2O
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
酶 /E
辣根过氧化物酶
底 物/DH2
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS（磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒
ELISA法筛查α-地中海贫血 ELISA法定量检测乙肝抗原两对半
……
基础医学领域的应用 ----ELISA试剂盒商业资讯
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
法医物证
……
环境卫生
酶催化底物液显色
DH2+ H2O2
（三）双抗体夹心法
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和 制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
（四）竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体。 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不 能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药 物等ELISA测定多用此法。
E
E
→
洗涤：3次， 1min/次
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
→
终止液终止显色
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
同位素131I标记抗体指示小鼠肿瘤
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅
待检样品孔显色明显 空白对照
ELISA标准曲线
Ab浓度（ng/ml）
注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光
测定波长
nm
492 460 449 425 642
400 500 405 420 360,450
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖苷
酶
黄色
420
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。 根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
操作步骤
每种液体均加100ul／孔
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 37 ℃ ，20min
加待检抗体：倍比稀释的兔抗 鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELI抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
倍比稀释法与加样
样 品 管 100µ L 第 一 管 100µ L第 二 管 100µ L第 十 管
S
600µ L
300µ L
300µ L
300µ L
1:400 A B 1 2 3
1:1600
1:6400
…….
4
5
6
7
8
9
10
11
每孔100ul,上下两排一致
从低浓度往 高浓度加,
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ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
（一）直接法
（二）间接法
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗体 以检测已与固相结合 的受检抗体，故称为 间接法。 其优点在于只要 变换包被抗原就可利 用同一酶标抗抗体建 立检测相应抗体的方 法。可用于传染病的 诊断。
倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高 浓度方向进行
终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 将加样枪调到最大量程（见加样枪顶部数字） 将所有剩余液体倒入水池，所有塑料制品开盖回 收到讲台
需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
免 疫 荧 光 技 术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
课程内容
ELISA的原理
ELISA的分类
间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
E
3.抗原或抗体的酶标记
间接ELISA