结核感染T细胞检测 细胞检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
IGRA
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
T-SPOT.TB
IFN-γ是参与结核病发病的一个细胞因子。效应T细胞被近期 暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。
四、华西医院结核病诊断的临床应用及研究进展
我院的结核及耐药实验室检测流程
患者临床标本
直接检测 核酸
Ziehl-Neelsen 染色 显微镜检查
MGIT960 液体培养
IGRA
核酸提取 及纯化
AFB阴性
AFB阳性
培养阳性
培养阴性
阴性有排除结 核病的价值 阳性提示结核 感染或结核病
实时荧光 PCR 阴性 阳性
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
1. Line probe assays线性探针测定法 Hain（LPA GenoType® MTBDRplus/Rsl）技术
2h
0.5 h
2.5-3 h
WHO建议使用Hain来检测 MDR-TB
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术 2. Xpert MTB/RIF
Xpert XDR
可以检测异烟肼，氟喹诺酮类药物和二线注射剂的耐药 测定正在开发中，尚未被WHO评估。 初步敏感性和特异性(与测序相比，尚未经同行评议): 异烟肼98.1%，100% 氟喹诺酮95.8%，100% 卡那霉素92.7%，100% 阿米卡星96.8%，100% 预计2018年面世
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
原理
针对靶基因的 6 个区域设计 4 条特异引物，利用链 置 换 DNA 聚 合 酶 在 等 温 条 件 (63-65℃) 下 30-60 min，即可完成核酸扩增
特点
不需双链DNA先变性成单链 扩增反应在等温下可持续进行 扩增效率高，15min-1h内实现109-1010倍的扩增 对 DNA 的扩增不需要热循环仪器。 当模板为RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样扩增
EasyNAT™ 结核分枝杆菌核酸检测
用等温交叉引物扩增技术( CPA，中国首个具有自主知识产权的核 酸扩增技术) 进行定性检测结核分枝杆菌，将病原体DNA扩增、核 酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，目标检测结核 分枝杆菌特异性IS6110片段 反应速度快，样本到结果2小时 检测成本低，只需离心机和水浴锅或金属浴 2014年被中国食品药物管理局批准用于检测肺结核
平台缺乏全面自动化
正在进行大规模的多中心评估，预计2017年底上市
检测样本多样化
stool
对于难以咳痰的患者的PTB 诊断，粪便可能是替代样本。
在痰涂片镜检和培养阴性的 HIV感染者的粪便中检测到 结核分枝杆菌
如果痰液不可用，Stool Xpert是疑似结核儿童的潜 在替代筛检。
技术产品本土化
截止到 2014 年末， GeneXpert 已累积生产了 17,883 组模块和 10,013,600 组标本盒，销往 145 个国家和 地区。
GeneXpert残留物进行其它耐药性分析
Xpert测定法处理的样品 残留物可用于PCR，以发 现与MDR和XDR-TB的 其他药物的抗性相关的突 变，无需培养或生物安全 基础设施，特别适合于不 可能进行表型药物敏感性 测试的环境
Truenat MTB
基于芯片的核酸扩增试验，样本在Trueprep-MAG™（电 池供电设备）进行处理，加载到Truenat，在Truelab Uno™ 分析仪（手持式、电池供电式热循环仪）上进行实时PCR。 样本制备到最终报告：<1h Truenat具有防污染/防蒸发设计的反应口，实现核酸隔离
RNA作为分子诊断靶标的技术
2. 恒温扩增检测 SAT 技术
DNA作为分子诊断靶标的技术 1. TB-DNA检测
1. 能稳定检测10 copy 的TB-DNA ，较 灵敏特异 2. 荧光定量PCR检出MTB阳性率显著高 于涂片染色和培养法 3. 早期、快速、准确地诊断结核病
痰液、支气管灌洗液——肺结核 血液——播散性结核和各脏器结核病 脑脊液——中枢神经系统结核病 宫颈/尿道拭子——泌尿生殖结核
Newer iterations of GeneXpert
Xpert MTB/RIF Ultra
手动操作时间：<1分钟
结果：<80分钟
敏感性更高，特别是涂片阴性结核病例 提高利福平耐药检测结果的准确性 改进混合感染的检测
WHO计划在2018年更新关于使用Ultra的政
策建议。
Newer iterations of GeneXpert
Sanger 测序
① PCR扩增待测耐药基因，对产物纯化之后测序，与其标准株的 同一
片段比较异同 ② 作为耐药突变分子生物学检测技术的金标准，能确定突变碱基的位置、 类型性质 ③ 操作繁琐，费用昂贵，多用于评价其他检测方法
焦磷酸测序 Pyrosequencing
一种以检测DNA 合成过程中所产生的焦磷酸（PPi）为基础的实时DNA 测 序技术，操作简单，准确性高，一次完成96 个样品的检测
亚能MTB耐药突变检测
高通量：检测MTB5个耐药基因（rpoB、katG、inhA、embB、
rpsL）的13种突变，结果提示4种一线抗结核药物（利福平、异烟 肼、链霉素、乙胺丁醇）的耐药信息。 快速：检测全程仅需8小时 性能好：检测的特异性达98%，准确性达95%，重复性达99%
测序技术与数据平台
三、诊断技术发展的多元化
诊断技术便捷化
检测样本多样化
技术产品本土化
测序技术和数据平台
诊断技术便捷化
GeneXpert Omni
全自动分子诊断POCT系统，为患者提供真正的即时床旁检测 轻便易携带（高23cm,重1kg）,方便在全球范围内推广 采用电池供电，需联网使用，涉及数据所有权 单盒式测试，一次只能检测一个样本 2015年AACC会议上亮相，预计2017年第3季度正式发布
以半巢式实时定量 PCR 扩增技术为基础，能够自动抽提 DNA 并且
扩增 rpoB 基因。设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心
区域所有可能的突变；用不同的荧光基团标记每个分子信标，仅在 一个反应中完成整个检测 2 小时内直接从病人痰液中检测是否有MTB及对利福平的耐药性
整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过 5 分钟，对
操作者和周围环境安全
2010 年 12 月，WHO 首次发布官方文 件推荐 Xpert MTB/RIF 技术的使用
2013 年，WHO 又再次发文更新了对 XpertMTB/RIF 的推荐意见：
当成人和儿童患者怀疑 MDR-TB 感染或合 并 HIV 感染时，强烈推荐 Xpert MTB/RIF 作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检， 培养和药物试验的方法。 对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液， 淋巴结和其它组织，推荐Xpert MTB/RIF 作 为检测方法。 对于痰涂片检测阴性的患者，推荐 Xpert MTB/RIF 作为后续检测方法。
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
3. DNA微阵列芯片
适用范围：MTBC鉴定，TB菌种鉴定， 利福平和异烟肼的耐药检测 分离株或者痰标本均可检测
原理：多重PCR扩增和反向杂交
菌种鉴定试剂盒同时快速检测包括结核 分枝杆菌在内的 17 种MTB
耐药试剂盒能快速检测分离株或者痰样 本的MDR-TB
原理：以rRNA 为靶标，采用线性探针技术检测 结核分枝杆菌复合群 检测时间: 2.5h

扩增 rRNA，TMA恒温扩增 动力快速反应，30分钟产生十亿扩增物 反应在单一试管进行，无须移液和清洗 产物为易自然降解 RNA，防止交叉污染
唯一获得FDA推荐的涂阴样本快速检测技术， 不使用PCR仪，无需专业PCR实验室认证
阴性
开展结核感染的宿主因素相关研究
01
SNP与结核易感性的关联研究 药物基因组学相关SNP与抗结核药物的不良反应 lncRNA在结核病中的诊断价值探讨及功能研究 结核病相关的表观遗传修饰改变（甲基化、miRNA）
02
03 04
建立结核病的生物样本库
结核生物样本库
结核菌株生物 库
信息相对应
宿主生物样本 库
评价
1.TB-DNA检测的限制步骤在于DNA的提取： 磁珠法提取DNA较煮沸裂解法和柱子法纯度 高 2. TB-DNA检测尤其适合于菌量少的体液标 本 3.血液标本除外，MTB检出率极低，可能和 前处理、核酸提取有关
Duo L, Ying B, et al. Molecular profile of drug resistance in tuberculous meningitis from southwest china. Clin Infect Dis. 2011 Dec;53(11):1067-73.
分子快速药敏检测 ①GenoType® MTBDR plus（利福平、异烟肼） ② GenoType® MTBDR sl（乙胺丁醇、氟喹诺酮、可
注射药物）
MTB药敏检测
① 14种一二线药物 ② 菌型鉴定 （MTBC、NTB、牛 型结核分枝杆菌）
③ 亚能MTB耐药突变检 测（利福平、异烟肼、链霉
素、乙胺丁醇）
特点：操作简便、 快速、 价廉。特异 性好，阳性率低，易造成漏诊。 涂片 特点：提高了镜检的灵敏度，缩短了检 测时间；缺点是假阳性率较高，需确证 方法（萋-纳染色）
Sputum
培养
固体培养及药敏试验—孵育4 周观察生长情况 平均时间2-3个月 液体培养及药敏试验 平均时间20天