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第一节 放射性核素和放射性标记物的制备 • 放射性核素作为放射性免疫技术的标记物， 选择何种放射性核素以及如何制备放射标 记物（将放射性核素与抗原或抗体连接）， 是建立放射免疫技术的基础。
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一、放射性核素的基本知识
• 基本概念 指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种
放射性核素转变成另一种放射性核素，并同时
• 检测免疫复合物的放射性，从而得到待检样本的
浓度。
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二、方法与类型
（一）单位点 IRMA
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（二）双位点 IRMA
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三、关键技术 抗原抗体反应 分离技术 放射性测定 数据处理
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（一）抗原抗体反应
*
Ag
(待检Ag)
Ab
固相 抗原 抗体 复合 物
Ab*
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前 言
• 放射免疫技术是将放射性核素高敏感的示踪特点 和抗原抗体反应的高特异性特点相结合的一种体 外测定超微量物质的新技术。 • 其基本模式是应用放射性核素标记抗原或抗体， 通过免疫反应进行定量测定。 • 具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试 剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，在医 学检验中得到了广泛应用。 • 放射免疫技术根据其方法学原理的不同主要有两 种类型：RIA和IRMA。
结果欠准，计算简便
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比放射性－自身置换法
比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定 标记物的比放射性。
作一条常规的RIA标准曲线，反应体系包括定 量标记抗原、不同浓度的非标记标准品抗原、 限量抗体；同时另作一条不加非标记标准品、 只加抗体和不同剂量的标记抗原的自身置换曲 线。
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（三）数据处理
晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm)
参数 cpm
B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%)
注：T即是B与F的总和
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四、评价与应用
IRMA的优点 效率高、操作简便 灵敏度高 特异型强 稳定性好 IRMA的缺点 抗体用量较多 抗体的纯化较难
释放射线（α、β、γ），又称为放射性衰变。 • 基本类型 依据其衰变方式 α衰变、β衰变、γ衰变 最常用的放射性核素是125I
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125I的优点
• 化学性质比较活泼，标记方法简单，且容易获得 高比活性的标记物； • 在衰变过程中产生γ射线，便于测量且效率高； • 半衰期适中（60天左右），且废弃物较容易处理。
Ch-T、 LPO氧化
125I或125I+
取代反应
125I-标记物
（混合物）
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使用无还原剂的 高比放射性碘源 被标记物用量要 少 Ch-T用量要低 控制总反应体积 <200μl 反应时间1分钟 ~2分钟 弱碱性反应条件 人民卫生出版社
（二）间接标记法
预先将125I用Ch-T法标 记琥珀酰胺酯，制成的 125I 化脂功能基团可与 蛋白分子上的氨基酸残 基反应，从而使待标记 物被碘化。
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第三节 免疫放射分析
• 免疫放射分析（IRMA）是从放射免疫分析 （RIA）的基础上发展起来的核素标记免疫 测定，其特点为用核素标记的抗体直接与 待检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为B 或F的分离手段。
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一、检测原理
• IRMA属于非竞争性免疫结合反应，其基本检测
原理是将放射性核素（125I）标记在抗体上，并 用过量的标记抗体与待测抗原进行非竞争性结合 反应，并采用固相免疫吸附方式对B和F进行分离。
免疫学检验
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第十九章 放射免疫技术
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本章要点
1. 2. 3. 4.
放射免疫技术的基本概念及类型 放射标记物的鉴定与纯化。 RIA和IRMA的测定原理及关键技术。 RIA和IRMA的临床应用与评价
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目
1 2 3
录
放射性核素和放射性标记物的制备 放射免疫分析性 免疫放射分析
分离彻底，迅速 分离试剂和过程不 影响反应平衡 效果不受反应介质 影响 操作应简单、重复 性好 经济
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（三）数据处理
晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm)
参数 cpm
B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%)
标准曲线
注：T即是B应用
RIA由于具有敏感度高、特异性强、精密度高、 重复性好、用血量少、可测定小分子量和大分子 量物质等优点，在医学检验中应用极为广泛，常 用于各种激素和药物等的测定。 但由于放射性核素的放射性对人体会产生一定 的危害性，且其废物的储存和销毁会对环境造成 污染，因此操作时必须加以注意。
RMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇 的肽类或蛋白质。抗体适用于大分子蛋白质和多 肽类激素的检测分析，如肿瘤标志物CA15-3，人 血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、 降钙素、HBsAg等，某些难以标记的病毒抗原也 可通过IRMA进行检测。
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小
结
放射免疫技术是应用放射性核素标记抗原或抗 体，通过免疫反应进行定量测定的一种技术。有 两种类型经典的放射免疫分析（RIA）和免疫放射 分析（IRMA）。 放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞 争性结合限量的抗体;免疫放射分析是将放射性物 质标记在抗体上，属于非竞争性免疫结合反应。 放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于 微量物质的定量测定。但由于放射性核素的放射 性对人体和环境会产生一定的危害和污染，因此 操作时必须加以注意。
牢固 的抗 原抗 体复 合物
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（二）分离技术
固相吸附分离技术 一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预 包被抗体稀释到3μg/ml~10μg/ml，室温过夜， 弃包被缓冲液（含有未结合物质和过剩标记 物），并洗涤去掉结合不牢固抗体，从而达 到分离的目的；然后，再加入1%牛血清白 蛋白溶液，封闭、保存备用。
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三、放射标记物的纯化与鉴定 （一）放射标记物的纯化
因游离的125I与 125I标记抗原（抗 体）分子的大小 相差悬殊，故采 用凝胶层析即可 进行分离纯化
标记蛋白
聚合、 损伤物
游离125I
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（二）放射标记物的鉴定
放射化学纯度 单位标记物 中结合于被标 记物上的放射 性占总放射性 的百分率 应大于95% 免疫活性 标记物与抗体 结合的能力 标记物与过量 抗体反应百分比 该值越大, 标 记物免疫活性好
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第二节 放射免疫分析
• 放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标 记的抗原（Ag*）与未标记抗原（Ag）竞争 结合特异抗体（Ab）来对待检样品中的抗 原进行定量测定的一种技术。
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一、检测原理
RIA属于竞争性分析， 其基本原理是由于Ag* 和Ag（待测物Ag)对特 异性抗体具有相同的结 合力，当三者同时存在 于同一反应体系时， Ag*和Ag相互竞争结合 特异性抗体。
Ag*和Ag具有等同的
与Ab结合能力
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Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加， Ag*与Ab结合形成 Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
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二、方法与类型
平衡法，即标记抗原、标准品抗原（或 待检样本）、特异性抗体同时加入反应 体系中。 非平衡法，即标准品抗原（或待检样 本）和特异性抗体，优先使非标记抗 原与特异性抗体达到平衡，然后再加 入标记抗原竞争与抗体结合。
125I的缺点
• 用125I取代H，可能使原物质免疫活性受到影响； • 易因发生辐射损伤而使标记抗原变性； • 作为商品化试剂的产品货架期较短。
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放射性核素放射活性的检测
利用射线照射闪烁体（NaI晶体），导致晶体 分子激发，在退激发时，闪烁体发出一定波长 的荧光；再由光电倍增管将极微弱的荧光转换 成光电子并放大107倍；从光电倍增管输出的 电信号经过放大器放大，经单道分析器甄别处 理，并在定标器上显示。
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二、放射性核素标记抗原抗体方法
直接标记法（氯胺T法） 主要包括 间接标记法
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（一）直接标记法——氯胺T法（Ch-T）
氯胺T将125I的I－氧化
125I-
为I+，I+取代蛋白质 酪氨酸苯环的氢，形 成稳定的放射标记物 （二碘酪氨酸），最 后加入偏重亚硫酸钠 （还原剂）终止反应。
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两种类型
(标准Ag/样品Ag)
三、关键技术 抗原抗体反应 分离结合标记物（分离技术） 放射性测定 数据处理
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（一）抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH
Ag
Ab
牢固 的抗 原抗 体复 合物
(标准Ag/样品Ag)
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（二）分离结合标记物
二抗体沉淀法 PEG 沉淀法 PR 试剂法 活性炭吸附法
自身置换曲线 标准曲线
反应平衡后，测定B/T%。 若从两条曲线上取一点相同的B/T%， 则（标记物+标准品）标准曲线= （标记物） 自身置换曲线。由此便可直接计算 标记抗原的含量，并进一步求得比 放射活性 。
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• 自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只 适用于RIA的标记抗原。使用时应注意： ①标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力 应相同； ②非特异性结合应较小，且计算时应扣除； ③制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤 应相同，特别是B与F分离的条件要一致。