Ｈｕｍａｎ
２
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ，２００４．１３（１８）：
１４３—２ １５３． Ｅ Ｒ１，Ｋｅｌｌｙ Ｊ Ｊ，Ｓｕｄ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｃａｐｒｉｎ一１ ｉｓ
Ｎｏｖ．
２０１４
Ｖ０１．３３
Ｎｏ．４
光周期为１４ ｈ光照／１０ ｈ黑暗，饵料为丰年虾，每日 中午饲喂１次。当天开灯后立即将收卵皿置于鱼缸 中，每２０～３０ ｍｉｎ收集鱼卵１次。
２．２
Ｇｆｉ表达强度进行相关性分析并进行结果统计。
３结果与分析
三型鱼中可以看到ＰＯＵ４ｆ３的神经丘及其侧线 组织，在野生型的鱼发育最强，而在缺失该基因的纯 合转基因鱼发育最弱，而杂交鱼介于二者之间。神经 丘位于脑部，包含有听觉及视觉的毛细胞，而侧线位 于身体纵轴与脊椎相平行，二者是斑马鱼的神经组 织。ＰＯＵ４ｆ３叫一、ＰＯＵ４ｆ３叫一和ＰＯＵ４ｆ３州＋分别见
ｔｉｓｓｕｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ １（Ｇｉｌｌ）ａｓ
ｌｉｋｅｌｙ
ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｕ４ｆ３．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｚｅｂｒａｆｉｓｈ；Ｇｆｉ；ＰＯＵ４ｆ３；ｎｅｒｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ｒｅｌｅｖａｎｃｅ
近年来，通过单核苷酸多态性、高通量基因测序、 基因芯片、基因组学等手段干预治疗癌症、遗传性疾 病、神经再生，使临床的诊治能够快速准确的应用此 技术。基因有些片段是无功能的，而蛋白质是生命活 动的基础，我们通过建立疾病的蛋白质组学发现基因 的相互作用，采用斑马鱼表达２个关联耳聋基因，观 察其中的相互关联作用。 １
Ｕ４ｆ３叫的鱼ｏ ４］
取野生型鱼和构
建的ＰＯＵ４ｆ３…一的鱼二者的雌雄比例均为５０％，按 前述的斑马鱼饲养方式饲养，收集受精卵发育成鱼。 饲养方法同前。将斑马鱼分为３组，分别为 ＰＯＵ４ｆ３。～、ＰＯＵ４ｆ３叫一和ＰＯＵ４ｆ３。“，提取这３组 鱼神经组织中的Ｇｆｉ（ｇｒｏｗｔｈ
［３］简清，白俊杰，叶星，等．斑马鱼Ｍｙｌｚ２启动子的克隆与转 绿色荧光的转基因鱼的构建［Ｊ］．中国水产科学，２００４，１１
（５）：３９１—３９４．
ｒ４］齐麟，冯晓，向志明，等．斑马鱼血清样淀粉Ａ基因在病毒 感染中的表达分析口］．河南大学学报：自然科学版，２０１３，
４３（５）：５４０—５４４．
［５］Ｈｅｒｔｚａｎｏ Ｒ，Ｍｏｎｔｃｏｕｑｕｉｏｌ Ｍ，Ｒａｓｈｉ—Ｅｌｋｅｌｅｓ Ｓ，ｅｔ ａ１．
浚 ，一－避
Ｚ
ａ：野生型斑马鱼表达Ｇｆｉ； ｂ：杂合型斑马鱼表达Ｇｆｉ； Ｃ：ＰｏＵ４ｆ３敲除纯合型的鱼表达Ｇｆｉ。 图４ 表１ Ｇｆｉ的ＲＴ—ＰＣＲ的表达图
及镫骨固定［ｓ－７３，还可以导致噪声性耳聋［８］。我们的 实验的结论提示，Ｇｆｉ与ＰＯＵ４ｆ３的表达有相关性。 我们是否可以通过干预Ｇｆｉ对ＰＯＵ４ｆ３的表达调节， 是对未来基因治疗的一个设想。 参考文献：
［１］朱新平，夏仕玲，张跃，等．转抗冻蛋白基因鲮鱼的初步研
究ｆＪ］．中国水产科学，１９９７，４（２）：７９—８０．
荧光显影ＰＯＵ４ｆ３＋卜、ＰＯＵ４ｆ３＋７一和ＰＯＵ４ｆ３—７一（条）
ＰＯＵ４ｆ３”７ ＰＯＵ４ｆ３“７
ＰＯＵ４ｆ３一合计
注：Ｘ ２＝１６．５７９，Ｐ一０．０１；）（２＝９．２，Ｐ＜０．０１。三组之 问有显著性差异。
ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｉｎ Ｅａｓｙ
图ｌ
Ｐ（）Ｕ
４ｆ：｛７侧线与神经丘组织
纯化后连入ｐＧＥＭ—Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒ，在ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７全自动荧光测序仪上进行序列测定。 ＤＮＡ分析软件Ｖｅｃｔｏｒ
２．２．２
ＮＴＩ Ｓｕｉｔ
６．０分析测定结果。 用培育线性化
构建ＰＯＵ４ｆ３叫一的鱼
河南大学学报（医学版）２０１４年１１月
第３３卷第４期
斑马鱼耳聋基因Ｇｆｉ与ＰＯＵ４ｆ３的关联性
冯
晓１’２，齐
麟３，孟
娟２
（１．河南大学淮河临床学院，河南开封４７５００１；２．郑州大学第一附属医院耳科，河南郑州４５００５２；３．铁道警察学院
治安系，河南郑州４５００５２）
摘
要：目的
运用转基因斑马鱼探讨信号蛋白Ｇｆｉ与ＰＯＵ４ｆ３之间关系。方法
ａｎ
Ｄｅｔｅｒ ｔｈｅ
Ｐｏｕ４ｆ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｉｌｄ ｕｐ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｏｕ４ｆ３，ｗｈｉｃｈ
ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
ｃａｎ
ｏｂｖｉｏｕｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｆｉ ａｎｄ
ａ
ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ
ｎｅｖｅｒ
中图分类号：Ｑ７８６
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２—７６０６（２０１４）０４—０２６７—０３
Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｆｉ ａｎｄ Ｐｏｕ４ｆ３ ｂｙ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ
ＦＥＮＧ Ｘｉａ０１一，ＱＩ Ｌｉｎ３。ＭＥＭＧ Ｊｕａｎ２
（１．Ｈｕａｉｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｅｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ，Ｈｅｎａｎ ４７５００１，Ｃｈｉｎａｉ ２．ａｆｆｉｃｉａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌＺｈｅｎｇ—
材料
ＤＮＡ模板提取试剂盒（日本Ｔａｋａｒａ公司）；其他
２
方法
２．１斑马鱼的养殖 野生型斑马鱼成鱼购自青岛国际斑马鱼资源中 心，养殖于（２８．５±１）℃的人工海水（反渗水配制， 高级海水晶，天津中盐海洋生物科学有限公司）中，
试剂均为国产分析纯；引物的合成由上海英骏生物技 术有限公司完成；ＲＴ—ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ
动荧光测序仪（美国ＰＥ ＡＢＩ公司）；构建ＰＯＵ４ｆ３基 因缺陷的鱼，以正常野生型的鱼作为对照，构建缺陷 鱼采用受精卵细胞胞内注射停止转系序列的ＤＮＡ 片段构建ＰＯＵ４ｆ３叫一的纯合体，正常野生型经基因 型分析确定为ＰＯＵ４ｆ３十／＋，野生型鱼与纯合型鱼共 同饲养，自然繁殖的受精鱼卵发育成鱼作为
ＰＯＵ４ｆ３＋／－。
ＧＡＡＣＧＧＣＡＡ ＧＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＣ；下
游：ＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＣＴＡＡ。以 斑马鱼基因组ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，反应条 件如下：９４℃预变性３ ｒａｉｎ＋每循环包括９４℃变性
１
ｍｉｎ，５５℃复性１ ｍｉｎ，７２℃延伸４ ｍｉｎ，共３０个循
环，最后１个循环结束后再７２℃延伸７ ｍｉｎ。扩增 片段经Ｗｉｚａｒｄ
图１、图２、图３。
ＰＯＵ４ｆ３缺陷的转基因斑马鱼模型构建 取２０ ｎｇ新
２．２．１提取ＰＯＵ４ｆ３的停止转录序列
鲜斑马鱼侧线及神经丘组织，按停止转录序列使用手 册提供的方法提取基因组ＤＮＡ；采用Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系 统，使用启动子与表达基因之间停止转录序列的方法 使ＰＯＵ４ｆ３不表达。根据Ｐｕｂｍｅｄ Ｇｅｎｅｂａｎｋ的斑马 鱼ＰＯＵ４ｆ３启动子基因序列的反向封闭使其不表达， 设计１对特异引物，上游：ＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴ—
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ
ａｓ
ａ
ｉｎｎｅｒ
ｅａｒｓ
ｆｒｏｍ Ｐｏｕ４ｆ３ｄｄｌ／ｄｄｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｇｆｉｌ
ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｕ４ｆ３ ｄｅａｆｎｅｓｓ
ｇｅｎｅＥＪ］．
４讨论
Ｐ０ｕ４ｆ３是ＩＶ ＰＯＵ转录因子，它的主要功能是 毛细胞发育，Ｇｆｉ是一个独立生长因子．表达ＤＮＡ双 螺旋结构蛋白的阻抑蛋白，是调节基因的产物，与操 纵基因的结合可以阻止受调节基因的表达。当阻抑 蛋白与操纵基因结合时，就会阻止ＲＮＡ聚合酶启动 转录，基因的表达就被关闭。在无阻抑蛋白时．ＲＮＡ 聚合酶可以识别受调节基因的启动子，使这种基因得 到表达。这一蛋白与听泡的囊性结构发育有关。近 年来发现斑马鱼与人类基因有高达８７％的相似性， 而斑马鱼表面的侧线与神经丘是一种类似于人体听 觉器官的结构。ＰＯＵ４ｆ３是ＩＶ ＰＯＵ转录因子，它的 主要功能是毛细胞发育，这在人类和小鼠的实验中已 得到验证。ＰＯＵ４Ｆ３的突变是人类常染色体显性遗 传进展性非综合征性耳聋的基础，而Ｇｆｉ是一个独立 生长因子，在体外实验中可以证实ＰＯＵ４ｆ３对于Ｇｆｉ
鱼全长为４
２１７
ｂｐ，实验中扩增长度为６４３ ｂｐ。对
ＰＯＵ４ｆ３一”、ＰＯＵ４ｆ３叫一和ＰＯＵ４ｆ３叫一中斑马鱼的
万方数据
河南大学学报（医学版）
２０１４年１１月
第３３卷第４期
２６９
有调节作用，ＰＯＵ４ｆ３导致耳聋主要是由于其突变影
：一参然耘ｉ
；
影州７
ｔ＂。
杉？
ｌ
响Ｇｆｉ表达。Ｇｆｉ对于胎鼠的毛细胞表达有很重要的 影响，有研究［５１表明在杂合子的胎鼠毛细胞可以发 育，但是在发育２天后会过早的发生凋亡。近年来的 研究表明，毛细胞能通过增殖或非增殖的机制支持细 胞再生，ＰＯＵ４Ｆ３在此过程中很可能对新生毛细胞 的迁移发挥重要作用；在毛细胞受到非致死性损伤 后，ＰＯＵ４Ｆ３还参与修复静纤毛。人类也有相应的 致聋基因ＰＯＵ４Ｆ３，位于ＤＦＮＡｌ５，即染色体５ｑ３１的 位置，缺陷时导致非综合征性聋，出现感觉神经性聋
ｚｈｏｕ。Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ ４５００５２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅｎａｎ ４５００５２，Ｃ壳ｉｎａ）
ｓｅｃｕｒｉｔｙ
ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｒａｉｌｗａｙ Ｐｏｌｉｃｅｍｅｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｕｓｉｎｇ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｆｉ ａｎｄ Ｐｏｕ４ｆ３ ｂｙ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｒｅ ｉｓ
［２］陈浩，杨健，王跃祥，等．ｖｔｇｌ启动子调控绿色荧光蛋白表