层析类别
主要依据的理化性质
吸附层析
吸附力
分配层析
分配系数
离子交换层析 分子的电荷性、极性
凝胶过滤层析 分子大小
亲和层析
亲和分子间的亲和力
此类的层析方法举例 磷酸钙凝胶层析 各种薄层层析、纸上层析
DEAE-纤维素柱层析 交联葡聚糖柱层析
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层析技术可按两相的状态不同进行分类，如以 气体为流动相的叫做气相层析（gas chromatography），以液体为流动相的叫做 液相层析（liquid chromatography）。
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大分子物质沿凝胶颗粒间 隙随洗脱液移动，流程短， 移动速率快，先被洗出层 析柱
小分子物质可通过凝胶网 孔进入颗粒内部，然后再 扩散出来，故流程长，移 动速度慢，最后被洗出层 析柱
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分配系数(kd)
Ve为某一被分离成分被洗脱时所用洗脱液的体积，称为洗脱体积； Vo为凝胶颗粒间自由空间的总容积，称为空白体积或外水体积； Vi为凝胶颗粒内部孔穴的总容积，称为内水体积或进人体积。
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4、层析装置的仪器化
HPLC
❖与微机、质谱等连用
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层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉淀、
有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其
它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特
点是简便、处理量大、既能除去大量杂
质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。
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第一节 凝胶过滤层析技术
又称凝胶排阻层析或分子筛方法 利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(多
由于固定相也有液体和固体的不同，故气相层 析还可细分为气—液和气—固层析两种，同理， 液相层析即可细分为液—液和液—固层析两种。
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根据流动相的形式：
液相层析、气相层析
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层析基本操作过程
装置选择
上样和洗脱
结果检测
基质均匀性 上样均一性 柱层析的L/d比值 洗脱装置
目的不同 检测方法不同
活性检测
析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶 颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小 的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的 路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
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凝胶是一种不带电
的具有三维空间的 多孔网状结构的物 质，每个颗粒的细 微结构及筛孔的直 径均匀一致，小分 子可以进入凝胶网 孔，而大分子则排 阻于颗粒之外。
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凝胶过滤层析的介质
葡聚糖系列 琼脂糖系列 聚丙烯酰胺系列 多孔硅胶
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基本操作
凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样 洗脱 凝胶柱的重复
使用与保存
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三、凝胶过滤层析的实验技术
(一) 凝胶的选择与处理
根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择 1.分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐 2.纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各
种凝胶的分离范围选用合适的凝胶
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粗粒 ，中粒 ：分离效果差，但流速快 ，可用 于工业上物质的制备
细粒 ：洗脱曲线峰形对称、峡窄、分离度好 超细颗粒 ：能给予最好分离，但流速慢，实验
时间长
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(二) 层析柱的选择 柱子要直，内径均一；下端死区小 柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽，
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体积参数
分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流
动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内
的洗脱行为。
Kd＝(Ve一Vo)／Vi
Ve Vo Vi
洗脱体积 外水体积 内水体积
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洗脱行为可以有三种可能的情况:
Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，
因而洗脱速度最快。即该成分的Kd＝0。
Vi＝Ve-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,
因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。
Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的
增加而降低
一般物质的Kd值是0<Kd< l。
lt; l Kd＝0
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Kd具有以下意义：
（1）对于完全被排阻的极端大分子，由于Ve＝Vo，因此Kd＝O （2）对于能自由扩散凝胶颗粒内部的小分子物质，Ve＝Vo＋Vi，Kd＝1 （3）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，Kd在0～ 1之间 （4）凡Kd＞1的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而
为凝胶)为填料，使混合物中的各种物质按其 分子大小不同得到分离。
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优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条
件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好
缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变
差
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一、凝胶过滤层析的基本原理
多孔性亲水性凝胶 一是随洗脱液垂直向下移动 二是无定向的扩散运动。 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层
第五章
层析技术
生物化学与分子生物学教研室 徐宏伟
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层析法也称色谱法(chromatography)，是1906 年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他 将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被
分开，由此得名为“色谱法”。
1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提
不仅仅是分子筛效应 （5）Kd值越接近1，表明分子越小，洗脱越慢；相反，Kd值越接近0，表
明分子越大，洗脱越快。
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柱床体积 (Vt) 为凝胶基架的总体积 (Vr) 与内水体积 (Vi) 及外水体积 (Vo) 之和。
实验室常用Vt－Vo代替Vi来计算分配系数， 所得值称为平均分配系数，用Kav表示，其定义为
对于某一特定的凝胶柱，Kav与kd之比是1个常数， 它不随溶质的性质或浓度而改变，因此可代替kd来度量被分离物的洗脱行为。
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影响分离效果的因素
流速 加样体积 样品浓度 离子强度
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二、常用凝胶的种类和性质
立体多孔网状结构，惰性 对pH和温度的稳定性 能反复使用 颗粒大小比较均匀 葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶。
出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展
奠定了基础。
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层析法最基本的特征是有一个固定相和一个 流动相，当两相作相对运动时，由于混合物 中各组分在物理化学性质 (如吸附力、溶解 度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲 和力等)上的差别，使各组分在两相间进行 反复多次的分配而得到分离。
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