银染
银染是非放射性染色方法中灵敏度最好 的，其灵敏度可达200pg 凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的 溶液中增敏，然后在AgNO3溶液中浸泡， 蛋白与银结合，银颗粒沉淀在蛋白点上， 沉淀的银颗粒产生催化反应，提高银染 反应灵敏度，使蛋白点显示棕黄色或棕 黑色
负染
负染是一种可逆染色方法，其灵敏度高 于考染低于银染，准备从胶上回收蛋白 可选用此方法，负染有铜染、锌-咪唑等， 灵敏度可达50 ng。负染在凝胶表面可产 生半透明背景，蛋白质以透明的形式被 检测出来，凝胶显示黑色背景或相应的 底色，染色过程很快，5-15min即可完成
蛋白质组学与分析技术特点
分析技术面广：氨基酸组分、序列测
定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管 电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪； 毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳； 蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白 质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高 能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学 技术
蛋白质组学与农业的科学实践
样品制备原则
1，尽可能采用简单方法进行样品处理，以避 免蛋白丢失 2， 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白 的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的 降解 样品裂解液应该新鲜制备、并且分装冻存于80C,不要反复冻融已制备好的样品 通过超速离心清除所有的杂质 加入尿素之后加温不要超过37C,防止氨甲酰化 而修饰蛋白
从生物样品抽提蛋白质
去污裂解：溶解细胞膜裂解细胞如SDS 还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化如 巯基乙醇、硫脲 变性剂：用于改变溶液离子强度和PH，破坏蛋 白质的二级和三级结构 酶裂解：用酶来消化细胞器如溶菌酶、纤维素 酶、果胶酶等 渗透裂解：用低渗溶液悬浮细胞 冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞，随后在37C 融化，反复几次
二维凝胶电泳图像采集
图象分析基本上依赖与各个蛋白质点的 光密度值相对大小 图象采集质量的因素包括系统的分辨率、 灵敏度、图象对比度和明亮度 常见的可见光扫描仪、荧光、化学发光 和磷屏扫描仪
存在的问题
低丰度蛋白质的检测 高丰度蛋白的去除 极酸和极碱性区蛋白的分离：pH <3或pH>11 高分子质量区蛋白的分离：100 000Da以上的 蛋白质很难进入胶条 定技术
低丰度蛋白的分离： 低丰度蛋白的分离 ： 尽管增加上样量和提 高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰 度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白 的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响 分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备 技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白 质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位 的IPG胶进行窄pH范围的分离。 高不溶性蛋白的分离： 高不溶性蛋白的分离 ： 主要还是要增加蛋 白质的溶解度，采用顺序抽提法进行。
清除影响二维电泳图谱的杂质
盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子：盐离子会干扰 电泳，可以透析去除 内源性小分子（如核酸、代谢物和磷酸）：这些物质带负电 荷，发生偏阳极侧聚焦不全，用TCA/丙酮沉淀去除 离子去污剂：SDS与多肽形成复合物，不能正确聚焦，通过 丙酮沉淀可去除SDS 核酸（DNA、RNA）：核酸增加样品的黏度导致背景弥散， 核酸通过电稳态相互作用也蛋白结合阻碍聚焦，核酸在银染 检测中导致高背景 多糖：阻碍凝胶孔径导致沉淀，多糖含有负电荷与蛋白质形 成复合物，用硫酸铵或苯酚/醋酸铵沉淀去除多糖 脂类：蛋白质与脂类形成复合物影响等电点和分子量，用强 变性剂和去污剂减少蛋白与脂类的相互作用 酚类组分：苯酚通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白，用巯基 乙醇或硫脲来灭活多酚氧化酶
蛋白沉淀步骤
硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀 TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质 可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA 丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离 心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除 在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效， 10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液 用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提 取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白， 丙酮清洗
实验样品的制备原则
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有 可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学 修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从 而保证待研究蛋白的可检测性。
1D-SDS-PAGE SDS-
一维等电聚焦电泳
蛋白质在不同PH值的溶液中带电荷情况是不同的， 在低的PH条件下，蛋白质静电荷为正，在高PH条件 下静电荷为负，在某一PH的溶液中，蛋白质的静电 荷为零，则此PH值为该蛋白的等电点 蛋白质等电点取决与氨基酸的组成，是一个物理化学 常数 如果外加一个电场，蛋白质会在电场作用下分别向正 极和负极漂移，当达到等电点位置时，蛋白不带电， 就不在漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理
2D-SDS-PAGE 存在的问题 SDS一维电泳相同蛋白质迁移的任何不同可能会被 误认为是样品中含有不同蛋白质 蛋白质的脱酰胺化、糖基化、磷酸化、氧化、 外源化学修饰等是相同多肽的不同修饰可能显 现为“点横向排列” 某些蛋白质不太适于进行第一维IEF电泳， 低溶解度导致蛋白质沉淀和聚集，造成在IPG 胶条中蛋白质的“成片条带”
2D-SDS-PAGE SDS-
样品制备
第一向 IEF电泳
第二向 SDS-PAGE电泳
染色 蛋白斑点的切取 图像采集和分析
二维电泳原理
Smithies和Poulik(1956 )最早引入二维电泳技术， O’Farrell（1975）根据蛋白质的等电点和相对分 子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上 按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照 相对分子质量大小进行分离 二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫 描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的， 呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质
蛋白质组学与分析技术特点
内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴
定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、 蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识 别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细 胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、 环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分 子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、 植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激 发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物 致病相关蛋白等等。
在IEF(水平)方向显示蛋白质“成片条带”的部分2D凝 胶
由于相同蛋白质的不同修饰/电荷显示“点横向排列”的部分2D凝 胶
蛋白质电泳图像分析
电泳凝胶后图象进行备份保存，从而以 数字化图象形式存储下来，尽量完整的 保留定性和定量信息以进一步分析，如 总蛋白的点数，蛋白点的表达丰度的电 量变化，蛋白点的缺失，利用双向电泳 凝胶分析软件进行分析
完整蛋白质的分离
1D-SDS-PAGE 2D-SDS-PAGE IEF(制备等电聚焦) HPLC 离子交换或亲和层析
聚丙烯酰胺凝胶电泳
通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按 一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合 形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链 聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自 由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDSPAGE按相对分子质量大小分离蛋白质
荧光染色
利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对不同蛋 白质样品进行荧光标记，并在一块2-D胶上同 步运行，由于两种修饰后的染料的激发波长不 同，在同一块胶上可用两个波长范围进行扫描， 并可得到两个样品的差异，灵敏度比银染要高 3-30倍 另一荧光染料是SYPRO Ruby，它是基于钌的 金属螯和染料，灵敏度为0.25-1ng
蛋白质组学的教学与其他课程的关系
与基因克隆和基因工程教学的异同点 与仪器分析课程的关系 与生物化学的异同点 与农学、植保、制药、免疫和疫苗、分 子生物学、作物育种、土壤肥料、家禽 饲料等的关系
蛋白质组学分析中蛋白质的分 离和消化
蛋白质组分析的基本流程图
蛋白质组研究的技术路线流程图
蛋白质的分离与纯化
蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
苯甲基磺酰氟PMSF: 不可逆抑制剂 AEBSF：灭活丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶 金属蛋白酶抑制剂乙二 胺四乙酸（EDTA）、 乙二醇双四乙酸(EGTA) 肽蛋白酶抑制剂：亮以酶肽，抑制丝氨酸、半 胱氨酸蛋白酶活性，为蛋白酶抑制剂A抑制酸性 蛋白酶活性，抑蛋白酶肽抑制丝氨酸蛋白酶， 本丁抑制素抑制氨基蛋白酶。 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、甲苯磺酰苯 丙氨酰氯甲酮（TPCK）: 不可逆抑制丝氨酸和 半胱氨酸蛋白酶。 Benzamidine: 抑制丝氨酸蛋白酶
剧烈的蛋白裂解
超声裂解法：通过超声波切应力来裂解细胞，在剧烈 的搅拌状态下会产生剪切效果 弗氏压碎器：在高压下迫使细胞穿过小孔径产生剪切 力裂解细胞 研磨法：组织和细胞常冻存于液氮中，研磨成粉状 机械匀浆法：将组织切成小片、匀浆、过滤或离心获 得裂解液 玻璃珠匀浆法：剧烈震荡的玻璃珠可以打破细胞壁， 释放细胞内容物
裂解液的组分
为了完成聚焦良好的第一项等电聚焦，蛋白质必须完 全溶解和解聚 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少 一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。 SDS作用后不利于稳定IEF中的等电点，不宜存在于IEF的 样品溶解液中；只有后两类表面活性剂是可用的，其中 CHAPS和SB3-10最好。 常用浓度为在8M尿素溶液中含2-5%的CHAPS，但在含 高浓度硫脲的溶液中其作用有限；SB3-10是一种含有长线 性基团尾端的两性去污剂，其作用要强于CHAPS，但在 尿素浓度大于5M时不溶解。
蛋白质作为人类食物主要营养成分存在于不同的农作物中； 蛋白质在植物生活中具有不同生物学功能（细胞调亡和细 胞器）； 蛋白质作为酶在植物生长代谢中期作重要的作用； 蛋白质作为生物信号传导的受体对外界信号在植物生活进 行传导； 植物中某些蛋白具有抗病虫的生物功能； 蛋白质及多肽能诱导植物抗逆性，促进植物生长和提高作 物品质；