蛋白质组学与分析技术课复习思考一、名词解释1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。

2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。

二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。

3、三步纯化策略：第一步:粗提。

纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第二步：中度纯化。

去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第三步：精细纯化。

达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析4、高效纯化策略在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。

5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。

如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。

固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。

阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。

其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。

离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。

6、吸附色谱吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。

洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。

7、PCR扩增PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。

进而推断出因序列的情况下使用。

PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补；3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。

典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。

8、基因组文库基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。

广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。

狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。

基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。

9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。

这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。

而从mRNA 出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。

10、基因芯片基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。

是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。

将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。

11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。

对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。

12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。

同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。

同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。

同源性更小时，从无到有法更有效。

一级序列――搜索数据库中已有结构的同源序列（或者结构域）――挑选模板蛋白――序列和结构配比――模建保守区域――模建环区――模建侧链二、简答题1．蛋白质组学主要包刮那些分析技术及各自特点内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物致病相关蛋白等等。

分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳；蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。

2.蛋白质组研究的技术路线流程图3.蛋白样品的制备原则与纯化原理一、实验样品的制备原则1)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。

2)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。

3)防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。

4)完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。

二、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法：透析和超过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH，不同蛋白在各自pI处依次沉淀。

2.盐溶和盐析：3.有机溶剂分级分离法（三）蛋白质的沉淀1．可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷，Pr结构和性质没有变化，适当条件下可重新溶解。

——非变性沉淀。

pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。

2．不可逆沉淀：强烈沉淀条件，破坏Pr胶体溶液稳定性，也破坏Pr结构和性质，沉淀不能再重新溶解。

——变性沉淀。

如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等。

4.简述高效液相色谱、气相色谱、质谱、液质联仪的工作原理及用途1）高效液相色谱：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

主要应用于氨基酸分析、肽和蛋白质的分离分析及糖类的分析，还包括蛋白质的分离纯化、氨基酸组成分析（氨基酸标本，N端测序）、蛋白质酶切肽段的分离、注入质谱后进行蛋白质组学的分析、样品纯度的粗鉴定。

2）气相色谱：3）质谱：质谱现象的就是不同电荷Z和质量m的各种离子碎片的质量（严格地说应是质量对电荷的比值，质荷比m/z），这些质荷比并不直接给出有关离子结构的信息，但是质核比不同的离子碎片的种类及其相对含量与试样分子的组成和结构有关。

通过对质谱的分析（试样分子可能产生的各种离子碎片分析）和根据已知的大量化合物质谱图的信息，来了解试样分子的结构、组成及其分解历程。

在生物蛋白质中，目前质谱分析能解决的主要问题是测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链中氨基酸排列顺序以及多肽键或二硫键的数目和位置。

质谱分析是解决核酸一级结构测定的最有利手段之一，包括分子量测定、核酸的序列分析；同时利用质谱测定寡糖和多糖的结构。

4）液质联用（HLPC-MS）：以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。

蛋白质样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

可以对每一个肽段进行序列分析，综合所有MS数据来鉴定蛋白质，大大提高了鉴定的准确度。

5.高效液相色谱有哪些主要特点它的分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂混合物的分离；它的应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成物质，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。

可以说几乎包括了所有类型物质；它可以根据分离对象，按不同分离机理，广泛选择色谱柱、淋洗体系和操作参数；它即是精细的分离纯化方法，也是快速、灵敏、准确、简便的分析检测手段；它可以处理从痕量、微量到常量以至较大规模制备的样品量，可以实现在线检测和自动化操作。

6.怎样进行蛋白质和多肽的氨基酸序列测定1.蛋白质的N端测序固相Edman降解是将蛋白质和多肽通过共价偶联在惰性载体上,因而蛋白质与多肽样品与多余的反应试剂以及切割后产生的氨基酸衍生物的分离就非常容易。

具体步骤：1）采用常规的SDS-PAGE方法，凝胶浓度通过前期的实验确定，电泳方法按照Laemmli方法进行.2）电印迹实验：将蛋白质印迹转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，然后将此PVDF膜片放入测序仪的反应室进行Edman降解。

最近，PE／ABI公司推出的配备毛细管HPLC的Procise—CLC型序列仪，PTH氨基酸检测的灵敏度可达0.1p mol。

3）根据各个氨基酸的色谱图与标准氨基酸图谱的对照，可以按顺序测定氨基酸的种类，从而得到蛋白质序列。

4）测序单位根据所提供样品的数量测定了N端的15个氨基酸的序列，足以用来进行PCR 引物的设计。

2.运用质谱进行肽段序列测定测序时，先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)和SV8酶(staphylococcus aureus V8)等。