肝糖原的提取与鉴定实验报告实验六肝糖原的提取实验六肝糖原的提取、鉴定与定量（生物化学实验操作考核卷）姓名，学号，专业，级班组，月日目的要求:1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。

5. 正确掌握溶液转移的操作。

6. 正确操作使用分光光度计。

实验原理:糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。

糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95, 乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。

这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。

糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

CuSO 什 2NaOH ? Na2 SO4+Cu(OH)2?2Cu(OH)2十 C6H12O6 ? 2CuO 十氧化型葡萄糖 +H2O2CuOH ? Cu2O?红色)+H2OCu(OH)CuO?(黑色)+H2O糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生 物—— 5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。

该物质 在620nm 处有最大吸收。

糖含量在（10?100）?g 范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。

利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比 色，通过标准对照法 （直接比较法 ）即可计算出样品中糖原的含量。

糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留 肝糖原。

实验材料 :（ 一 ） 仪器1. 普通离心机，室温？100?恒温水浴箱（X 2） , 722型分光光度计，精度为 10mg 级电子天平（X 1）试管架（X 1），10mL 离心管（X 2），（100 X 15）mm 试管（X 6）刻度吸量管（2mL X 1，5 mL X 2），1000^L 微量可调取液器（X 1）5. 100mL 容量瓶(X 1)6. 白瓷反应板 （X 1）（ 二） 实验样品和试剂1. 鸡肝。

2. 95, 乙醇。

3. 0.31mol/L(5,) 三氯醋酸溶液 :称2. 剪刀（X 1），镊子（X 1），研钵（X 1）3. 4.取未潮解的三氯醋酸(C2HCl3O2，163.39)5g ，加蒸馏水溶解至100 mL。

4. 0.15mol/L NaCl 溶液:称取8.8g NaCl 加蒸馏水溶解至1000 mL。

5. 12mol/L HCI: 浓HCI 原液(36%?38%)6. 12.5mol/L(50,)NaOH: 称取NaOH 50g 用蒸馏水溶解至lOOmL7. 碘试剂：碘lOOmg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中。

8. 班氏试剂: 称取柠檬酸钠(C5H5Na3O7?5H2O294.10)173g 和无水碳酸钠(Na2C03，105.99)100g 溶于蒸馏水800mL中，加热促溶。

冷却，慢慢倾人17.3,硫酸铜(CuSO4?5H2O249.68) l00mL,边加边摇。

再加蒸馏水至1000mL混匀，如混浊可过滤取滤液。

此试剂可长期保存。

9. 5.35mol/L(30,)KOH 溶液：称取KOH 30g加蒸馏水溶解至100 mL。

11. 标准葡萄糖液(50mg/L):称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg加蒸馏水溶解至500 mL。

12. 17mol/L(90,)H2SO4:量取蒸馏水30mL 加浓H2SO4500 m。

13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。

此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4?5 天。

实验方法:吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。

( 一) 肝糖原的提取与鉴定操作流程如下。

鸡肝约1 g ，剪碎，5%CCl3COOH 1 ml5%CCl3COOH 3 ml研磨成肝匀浆3分钟(4000 r / min)，5 ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟4000 r / min)上清（弃去）沉淀，蒸镏水2 ml鉴定方法?1ml，浓HCl 0.2mL0.1mL(2 滴)，班氏试剂0.2mL（4 滴）混匀沸水浴2注意事项1. 肝糖原提取一步，向上清液中加入5mL95乙醇后，务必注意混匀。

由于上清液为水溶液，比重大于95,乙醇，溶液分成两层。

加之上清液已3mL多，总量接近9mL混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀, 或用玻璃棒搅拌混匀。

2. 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。

葡萄糖残基在20 个以下的会使碘呈现红色，20?30个之间使碘呈现紫色，60 个以上的会使碘呈现蓝色。

淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20 个以下（通常8?12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。

3. 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。

（二）肝糖原定量测定操作流程如下鸡肝0.070.15 g , 30%KOH 1.5ml沸水浴15 分钟取干净试管4支，按下表操作。

试剂（ml）蒸馏水标准葡萄糖溶液（0.05mg/mL）糖原消化液0.2%蒽酮溶液定其余各管溶液的吸光度（A）。

计算:肝糖原（g/100 g肝组织）=考核操作内容： 1（吸量管操作（5 分）;2（可调式微量取液器操作（5 分）; 3（溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（5 分）;4（溶液转移操作（5 分）; 5（分光光度计比色操作（5 分）。

操作标准：面每1 项操作满分记5 分，操作共计25 分。

1（执管：要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度; 吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。

2(坐姿: 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。

3(吸取溶液：吸量管插入液面深度约0.5cm,不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内; 调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。

4(排出液体：吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。

不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3 秒。

( 二) 可调式微量取液器操作1( 设定容量值：转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。

顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。

在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。

2( 吸液：(1) 选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间A样品A标准X 0.05 100肝组织重(g) X 100 1000 Xl.11空白管1.0 -------------------- 2.5 标准管一1.02.5 样品管——1.0 2.5 混匀，沸水浴10分钟，冷却。

在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测隙;(2) 把按钮压至第一停点，垂直握持加样器, 使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3 秒，使管尖外侧的液滴滑落。

3( 放液：(1) 将吸头口贴到容器内壁底部并保持100?~40?倾斜;(2) 平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体;（3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。

按吸头弹射器除去吸头。

4（压放按钮时保持平稳; 加样器不得倒转; 吸头中有液体时不可将加样器平放。

取液器吸嘴为一次性使用。

实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。

（三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的3 处）1（肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5mL95乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

2（肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 mL容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。

3（肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约450再作旋转混匀。

因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管底（加试剂的顺序一定不能颠倒），不倾斜试管旋转混匀不了。

（四）溶液的转移（操作流程中下划波纹线的两处）1（在研钵中研磨后的肝匀浆转入试管离心可用滴管或取液器吸取转移，如果采用倒入，不能洒落管外，应尽量转移干净。

2（肝组织沸水浴后的消化液转入100 mL容量瓶前应冷却；转入时用玻璃棒引入，玻璃棒头插入容量瓶靠瓶颈磨口下约1cm处，玻璃棒上端不要靠上瓶口边沿，引入时试管口靠玻璃棒的位置靠近容量瓶口，不要离开瓶口太高，以免消化液沾染玻璃棒较长；转入过程中，溶液不要沾染到容量瓶磨砂口上，更不能滴洒到容量瓶外面；应用蒸馏水洗消化管3 遍以上，洗液一并全部转入容量瓶。

（五）分光光度计操作1（波长选择，仪器调零，空白调零，灵敏度挡选择等操作正确。

2（手拿比色杯毛面。

3（比色溶液不能洒落比色杯外或试管外。

4（比色过程操作正确。

实验结束后，器材按要求清洗干净、器材与试剂瓶归回原位和台面卫生满分5实验报告结果要求1（肝糖原的提取、鉴定鉴定方法?和鉴定方法?中最后的“呈色对比”和“观察颜色变化”，结果一定要明确表达是“有变化”或“没有变化”，有变化的话还要具体写出变成什么颜色了。

而且要作出篇二: 肝糖原的提取和鉴定肝糖原的提取和鉴定、实验目的1、学会和掌握肝糖原提取和鉴定的原理和方法。

2、正确掌握使用离心机的方法步骤。

、实验原理三、实验步骤（一）、肝糖原提取1、用脱臼法处死白鼠，立即取出肝脏，迅速以滤纸吸取附着的血液。

称取肝组织约2g,置研钵中，加入10汇氯乙酸2ml，用剪刀把肝组织剪碎，再加石英砂少许，研磨5min。

2、再加5%三氯乙酸4ml，继续研磨1min,至肝脏组织已充分磨成糜状为止,转入离心管，然后以2000r/min 离心10min。

3、小心将离心管上清液转入另一个离心管中，加入同体积的95%乙醇，混匀后，此时糖原成絮状沉淀析出。

4、溶液以2000r/min离心10min。

弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上1~2min。

5、在沉淀内加入蒸馏水2ml,用细玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即成糖原溶液。

( 二) 、鉴定1、取2支小试管A、B, —支A加糖原溶液10滴，另一支B加蒸馏水10滴,然后在两管中各加碘- 碘化钾溶液1 滴，混匀，比较两管溶液颜色有何不同。