2015-4-性的过程，有时非常困难。活性
蛋白质的终产量低。
• 形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。
• 细胞质还原的环境不利于形成二硫键
• N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响
• 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。
2015-4-18
17
②周质中表达 • 周质（periplasm)—大肠杆菌一类格兰氏 阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞
2015-4-18 6
常用的大肠杆菌启动子
• Plac
• Ptrp
来源于乳糖操纵子
来源于色氨酸操纵子
• PL
• PrecA
来源于λ噬菌体早期操纵子
来源于recA基因
2015-4-18
7
启动子的可控性
目前使用的大肠杆菌启动子，一般含 有与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由 这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细 胞内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖 的培养基内， Plac 启动子处于阻遏状态，
3、蛋白质的化学修饰
简单的化学修饰： 将乙酰基、甲基、磷酸基、羟基等小基 团加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧 基端 不同蛋白质可以有完全相同的修饰 相同的蛋白质可以有完全不同的修饰 磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用
结构
• 表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过
细胞内膜到达周质
2015-4-18
18
优点： • 蛋白种类少，易纯化 • 酶解程度低 • 促进二硫键的形成和蛋白质的折叠 • 蛋白质N-端真实性 缺点： • 转运的效率不稳定
2015-4-18
19
③ 表达产物分泌到细胞外 • 诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质 • 利用信号肽； • 融合蛋白配体； • 透化剂；
30
酵母菌的种类
• 酵母菌（Yeast） 有56个属500多个种组成。 如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统， 则酵母菌是最成熟的真核表达系统。 常用的有： 酵母属（如酿酒酵母） 毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母属） 裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母）
2015-4-18 31
一.啤酒酵母
• 啤酒酵母又名面包酵母，被称为真核生物
12
2015-4-18
此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组
成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色
氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含
色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。
2015-4-18
13
原核表达存在的问题 翻译后的加工修饰 真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还 需要加工和修饰，如糖基化，但大肠杆菌 细胞无此功能。 细菌蛋白酶的存在 细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割
2015-4-18
27
短小芽孢杆菌表达蛋白质
• 例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需 复性处理，即具有生物活性。产率达 50mg/L。 • 例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率 达1g/L以上。 澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊 毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自 行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后 可用手直接抓下羊毛。
9
温度诱导
PL启动子 将工程菌先置于300Ｃ进行培养， 在此温度范围内，由大肠杆菌合成的CI 857阻遏蛋白与PL 的操纵子区域结合，关 闭外源基因的转录。当工程菌培养到合适 的生长阶段，（一般为对数生长中期）时， 迅速将培养温度提高到42 0Ｃ，此时CI 857 失活，从操纵子上脱落下来， PL启动子遂 启动外源基因转录。
，这一序列称为信号序列 。
常见的信号序列由10～40个氨基酸残基
组成，N端为带正电荷的氨基酸残基，中间为
疏水的核心区，而C端由小分子氨基酸残基组
成（加工区），可被信号肽酶识别并裂解。
•
信号假说：分泌型蛋白质的定向输送，就是
靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）
识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对
2015-4-18
20
蛋白质合成后的靶向输送
•蛋白质的靶向输送(protein targeting)
蛋白质合成后需要经过复杂机制，定
向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部 位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。
• 信号序列(signal sequence) 所有靶向输送的蛋白质结构中存在分 选信号，主要为N末端特异氨基酸序列， 可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位
牛溶菌酶； 乙肝表面抗原； 链激酶； 人肿瘤坏死因子； 人表皮生长因子； 人组织纤溶酶原活化剂； 破伤风毒素片段C；
2015-4-18
39
乳酸克鲁维酵母 牛凝乳酶；人白细胞介素1β ； α －半乳糖苷酶 多型汉逊酵母 乙肝表面抗原 葡萄糖淀粉酶 α －半乳糖苷酶
2015-4-18
40
第三节 昆虫细胞表达系统
二.甲醇酵母表达体系
2015-4-18
34
1.甲醇酵母的生物学特点
• 甲醇酵母是一种甲基营养型酵母.在缺乏碳
源如葡萄糖\甘油时,能利用甲醇作为唯一的
碳源;生长温度28-30C。
如巴斯德毕赤酵母就是常用的表达系统。
2015-4-18
35
2.甲醇酵母表达系统的优点
• 具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启 动子，可严格调控外源蛋白的表达 • 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行 翻译后的加工和修饰，从而表达出有生物 活性的外源蛋白 • 营养要求低，生长快，培养基廉价，便于 工业化生产 • 可高密度发酵培养.
2015-4-18
46
杆状病毒载体的构建
以pUC质粒为基础构建，提供Amp抗性；
多角体蛋白编码基因的启动子；
多克隆位点位于该启动子的下游；
家蚕丝心蛋白编码基因启动子：被认为是自
然界最强的启动子，但由其介导的外源基
因高效表达对宿主细胞的生理过程有干扰。
2015-4-18 47
二.昆虫细胞宿主 • 常用的宿主为sf9和sf21。 来源于草地夜蛾的卵巢细胞。
2015-4-18
42
家蚕表达系统
• 家蚕属于鳞翅目家蚕科，人类饲养家蚕已
有5000余年历史。我国是家蚕业的发祥地， 自古以来农桑并茂，丝绸之路名扬天下。 我国的生丝产量占世界总产量的70％，丝 绸业的年产值达700亿元。
2015-4-18
43
我国科学家于2003年率先完成家蚕基
因组框架图，覆盖率和精确度分别达到
2015-4-18
48
第四节 哺乳类细胞表达系统
优点：哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质，
包括二硫键的形成、糖基化、磷酸化、寡聚体
的形成、蛋白酶的定点切割产生具有天然活性
的蛋白质
缺点：细胞生长缓慢，培养周期长；
生产成本高；
2015-4-18
49
2．蛋白质切割
• 末端切割 膜蛋白、分泌蛋白：在氨基端具有一段信号 肽。信号肽必须切除多肽链才具有功能。 脊椎动物前胰岛素原长 105aa ，首先切除氨 基端的24aa，成为前体胰岛素 再将中间的一段切除，留下两端有活性的部 分，即21aa酸残基的A链和30aa的B链 两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰 岛素。
95.54和99.95，是我国科学家向人类社会 贡献的第三大基因组研究成果。
2015-4-18
44
• 家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝
的主要成分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋 白合成期，每个细胞每秒合成数万个丝素 分子。
2015-4-18
45
杆状病毒载体
• 杆状病毒是含有包膜的双链DNA病毒，宿 主为无脊椎动物。主要感染昆虫，包括鳞 翅目、膜翅目、鞘翅目、毛翅目等。 杆状病毒表达载体可分为两大类： 1.表达单个外源基因 2.表达多个外源基因
第七章
外源基因表达系统
2015-4-18
1
基因工程所用的宿主菌,皆经过人工改造
原因是
野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统, 会切割未经修饰的外源DNA.
经过改造的宿主菌一般具备下列特点 限制系统缺陷型:不切割外源DNA. 重组缺陷型 :避免外源DNA与宿主DNA的重组. 转化亲和型:改变细胞壁的通透性,提高转化效率.
接蛋白（DP， 即SRP受体）结合后→开放膜 蛋白通道→分泌性蛋白穿过膜→膜外侧面信 号肽酶切断信号肽加工区。
信号肽的一级结构
优点：
• • • • 酶解作用低 纯化方便 增进蛋白折叠 N-端的结构真实
2015-4-18
26
分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋 白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很 难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源 基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比 包涵体方式低很多。
外源基因极少表达。
2015-4-18
8
• 当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养
物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖
苷 isopropylthiogalactoside，IPTG),它
们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵
子上脱落下来，启动子打开并启动外源基 因转录。（化学诱导）
2015-4-18
2015-4-18 36
• 表达量高，数百mg/L以上水平
• 表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到 胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背 景蛋白）非常少，十分有利于纯化。
• 糖基化程度低。
2015-4-18
37
多型汉逊酵母表达系统
• 已用于表达乙肝表面抗原
2015-4-18
38
3.应用举例
毕赤酵母
2015-4-18 10
化学诱导与温度诱导在实验室 规模比较容易做到，（发酵罐1～5
升）。但在工业化生产时（发酵罐
数十升～数百升乃至数千升），生
产成本很高。
2015-4-18
11