相关概念
• 高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列， 是比较短的，叫read，它们是原始数据；有很多reads通 过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig； 多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold；一 个contig被组成出来之后，鉴定发现它是编码蛋白质的基 因，就叫singleton；多个contigs组装成scaffold之后，鉴定 发现它编码蛋白质的基因，叫unigene。 • Unigene是UniqueGene的英文缩写，意为广泛通用的基因 数据库，通过电脑对相同基因座(Locus)的收集整理集合 形成一个非冗余的基因数据库。
• 测序质量控制：Q20% >80
相关概念
• 高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值， 这个质量值是衡量测序准确度的。Q20与Q30则表示质量 值大于等于20或30的碱基所占百分比。 • Q20值是指的测序过程碱基识别过程中，对所识别的碱基 给出的错误概率。 • 质量值Q20，错误识别概率是1%，即正确率是99%； 质量值Q30，错误识别概率是0.1%，即正确率是99.9%； 质量值Q40，错误识别概率是0.01%，即正确率99.99%； Q“N”0的质量值，就是正确率有N个9的百分比。 • N50 即覆盖50%所有核苷酸的最大Unigene长度或覆盖 50%所有核苷酸的最大序列重叠群长度。
转录本
All transcripts
All mRNAs
Total RNA样品检测
• OD260/280:1.8~2.2； • RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7 ； • 样品总量不低于15ug； • 样品浓度：total RNA浓度不低于400ng/ul。微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片段两 端 ������ 高保真聚合酶扩增构建成功的测序文 库
相关数据库概念
• NR是NCBI里的非冗余蛋白数据库，即NCBI的blastp程序中的NR数据库 ，我们可 以用自己的query序列，blast搜索这个数据库，得到这些query序列的具有序列相似 性的蛋白序列。 NT：NCBI的blast页面，选择nucleotide blast，数据库选others，也就是（nr/nt）. SWISS-PROT是经过注释的蛋白质序列数据库，由欧洲生物信息学研究所(EBI)维 护。 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)是 基因组破译方面的数据库。 COG是Cluster of Orthologous Groups of proteins（蛋白相邻类的聚簇）的缩写， 即直系同源基因数据库。 COG是对基因产物进行直系同源分类的数据库，每个 COG蛋白都被假定来自祖先蛋白，COG数据库是基于细菌、藻类、真核生物具有 完整基因组的编码蛋白、系统进化关系进行构建的，我们将Unigene和COG数据库 进行比对，预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计，从宏观上认识该物种 的基因功能分布特征。 GO(gene ontology)是基因本体联合会(Gene Onotology Consortium)所建立的数据库， 旨在建立一个适用于各种物种的，堆积因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随 着研究不断深入而更新的语言词汇标准． • • • •
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx） 5. 数据分析 ������ 原始数据读取 ������ 与数据库比对并进行注释 ������ 深层次数据分析
实验流程
标准信息分析流程
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps
De novo reads组装流程
Unigene GO 分类
Unigene COG 功能分类
基因表达差异分析
N1:total tag Number in sample A
N2:total tag Number in sample B
X :Gene expression level in sample A y :Gene expression level in sample B Reference: Audic S. et al. The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 1997 7(10):986-995
转录组？ • 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态下所能 转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编 码RNA。 • 转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件 下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指 所有mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要 承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描 述，转录组成为研究基因表达的主要手段，转录 组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组 的必然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的， 也是生物体最重要的调控方式。
转录组测序(RNA-Seq)
Jun Yang
RNA-Seq 的技术背景
• RNA-Seq又称转录组高通量测序(transcriptome sequencing)或称为全转录组鸟枪法测序(Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS) • 2005年以来, 以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标 志的新一代测序技术诞生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出单分子测序(Single molecul深度 测序或高通量测序。
环境转录组也可以这样做
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化 • 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析
• 基因融合鉴定
有参考基因组序列信息分析流程
无参考基因组生物信息分析
• • • • • • Unigene功能注释 Unigene的GO分类 Unigene代谢通路分析 预测编码蛋白框（CDS） Unigene表达差异分析 Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway 富集性分析
•
相关概念
• 基因的编码区(Coding region），亦称为 “编码序列”（Coding sequence）或 “CDS”（Coding DNA Sequence），是指 mRNA序列中编码蛋白质的那部分序列。 CDS也等同于ORF（open reading frame） 是编码蛋白质的序列，以ATG开始--终止密 码子结束。
Unigene pathway 富集性分析
Pathway富集性分析列表
Thank you！
环境转录组也可以这样做
• 使用RNA-seq手段对实验样本进行转录组分析，关注个体或者组织器 官在不同环境条件下基因表达的动态变化，挖掘生物对逆境适应的分 子机制。 • 方案设计思路建议： • （1）植物个体受到较多环境因素的影响，包括温度、干旱、涝害、 光照、盐碱、污染物、虫害以及病原菌侵染等等,相应采取的应答策 略也较为多样，可以通过激素信号分子和细胞表面受体调控相关基因 的表达。建议设置多个关键处理时间点，研究植物个体短时间内和长 时间内转录组动态变化趋势；揭示同一器官组织在不同环境胁迫下或 不同器官组织在同一环境胁迫下基因的时空表达模式； • （2）动物器官组织样本主要来源畜牧动物、水产动物、昆虫、人以 及模式动物小鼠和线虫，关注点为温度处理、光照处理、污染物处理、 病原菌/虫感染、用药前后特异性表达基因，根据基因表达模式分析 揭示器官组织响应环境胁迫过程的分子机制； • （3）对于微生物样本，主要通过环境转录组分析不同培养环境、次 生代谢产物积累以及毒素产生差异基因表达，解析环境诱导活性物质 生产的分子机理。