论人源化单克隆抗体的研究进展***（生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080）摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。
随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。
本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。
关键词：单克隆抗体人源化临床治疗Theory humanized monoclonal antibody research progress***(The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article.Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment1975年。
Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。
1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。
然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。
这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。
然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。
直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一些技术突破，如用PCR 方法扩增抗体可变区基因、大肠杆菌表达功能性抗体片段以及噬菌体展示抗体功能片段等，这些技术为抗体人源化和人抗体的研究奠定了基础。
1、人源化单克隆抗体的构建鼠抗体人源化的构建就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA 反应。
当用人的序列代替鼠的框架时，其氨基酸残基的接触作用发生改变，进而影响鼠抗体互补决定区( Complementaritydeterm ining re ign, CDRs)的空间构型而使其抗原亲和力降低或消失[4]。
人源化单克隆抗体的构建经历了非人源抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体等的先后发展，最终制备全人源化单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库。
1.1、嵌合抗体20 世纪80 年代中期开始研制的第一代人源化抗体, 即简单的嵌合抗体, 是利用DNA 重组技术将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中, 转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体, 其人源化程度达到70% 左右。
这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性, 又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。
“Rituximab”作为第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体, 就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。
但由于嵌合抗体可变区( V) 约占整个抗体的30% , 鼠源性抗体V 区中的框架区( FR) 仍残留一定的免疫原性, 可诱发HAMA 反应[5]。
虽然嵌合抗体仍有30%左右的鼠源性成分，但90%的HAMA 反应是针对抗体恒定区的[6]。
为了降低在嵌合抗体中鼠源部分, 只移植鼠抗体互补决定区( Complementaritydetermining reign, CDRs), 而不移植整个抗体可变区, 所构建的“嵌合”抗体随后就成为了研究热点。
1.2、CDR 移植的人源化抗体由于鼠源性抗体V 区中的FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。
为减少鼠源成分, 人们进一步用人的FR 替代鼠FR, 形成更为完全的人源化抗体，即鼠源单抗上六个CDR 通过PCR 等方法克隆到人抗体相应的框架区(FR) 上构建成新抗体。
与嵌合抗体相比, CDR 移植进一步减少了抗体中异源序列的含量, 降低了抗体异源性, 其人源性可达90% 以上[7]。
但对于特定的抗原分子来讲，FR 并不是可以随意替代的。
具有支持作用的FR 不仅为CDR 的构象提供了环境, 有时还参与抗体结合位点正确构象的形成, 甚至参与抗原的结合。
因此, 简单CDR 移植到人抗体FR而忽略某些关键位点的氨基酸残基，往往会明显降低抗原- 抗体反应的亲和力, 甚至丧失与抗原结合的能力[8]。
多数情况下, 仅仅移植CDRs到人抗体FR 上产生的改型抗体将丧失全部或大部分抗原亲和力, 只有同时再移植某些关键位点的氨基酸残基后才能保持改型抗体的抗原亲和力。
所以，在抗体重构试验中, 识别人源抗体框架区中影响CDR构象的氨基酸残基位点非常关键。
近年来人们利用抗体基因库，通过对抗原-抗体相互作用的计算机模拟, 并分析氨基酸残基、CDR的几何距离和分子间氢键作用力, 可以推测出这些关键氨基酸残基的位点, 指导抗体重构试验。
袁清安等[9]对肝细胞癌特异性抗体HAb52可变区进行了同源模建，然后分析决定CDR初始构象的可能残基，对所有的暴露残基都进行人源化，改构后的抗体的免疫原性明显地降。
尽管人源化单克隆抗体人源化程度达到70%左右, 在抗原特异性和亲和力方面都较好地保留了亲代抗体的特征, 而免疫原性则降低至12%左右, 在体内的半衰期和效应功能也更加接近于人抗体。
但由于人源化单克隆抗体( 嵌合或CDR 移植抗体) 内还含有10%～30%的鼠源蛋白, 因而在临床应用时, 或多或少地存在一些免疫排斥反应, 没有达到治疗性抗体发展的最终目标——抗体完全人源化。
1.3、全人源化抗体全人源化抗体是治疗性抗体的发展趋势，随着抗体工程的快速发展，目前生产全人抗体的方法已达到比较成熟的阶段, 主要包括抗体库技术和转基因小鼠技术[10]。
抗体库技术主要是将抗体重链可变区( V H ) 和轻链可变区( V L ) 基因与噬菌体的外壳蛋白( P ) 或外壳蛋白( P ) 基因随机重组, 继而感染大肠杆菌, 经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv- 外壳蛋白融合蛋白的形式表达[11]，从而获得相应的特异性抗体。
抗体库技术的发展使体外不经过免疫获得抗体成为可能，即用PCR 技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列, 克隆到噬菌体载体上, 并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面, 用固相化抗原,通过反复吸附-洗脱-扩增的过程, 从而筛选出特异性PhAb片段[12]。
此项技术不仅可以获得具有人体性质的单克隆抗体, 而且利用抗原可直接从抗体库中筛选出所需基因, 而不需要细胞融合, 甚至不需经过免疫动物, 实验周期短, 过程较简单, 这是人源抗体制备技术的重大突破。
此外，由于细菌细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体，进行蛋白晶体结构研究和应用。
因此，抗体库技术将对生物学和医学的发展起着重要的推动作用。
另一条生产人源化单克隆抗体的途径是通过基因敲除技术, 使小鼠自身的基因失活, 并导入新基因, 创造出携带人抗体重轻链基因簇的转基因小鼠。
这种转入抗体基因的小鼠所携带的人DNA片段具有完备的功能, 可有效地进行同种型转换和亲和力成熟。
任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。
该领域的最新进展是所谓“转染色体小鼠”的产生。
这种小鼠携带人微小染色体, 即从人14及2号染色体上分离的含有全部人抗体重轻链胚系基因簇(包括所有的V、D、J片段和抗体恒定区) 的染色体片段。
这种携带微染色体的小鼠能够提供几乎完全相同的人免疫球蛋白基因环境并在鼠体内精确的重现了人抗体的产生过程。
另外, 利用该技术还获得了抗表皮生长因子受体(EGRF) 、TNF-α、CD4 等的完全人抗体[13]。
2、人源化单克隆抗体的临床应用近十几年来，随着分子生物学技术和抗体工程技术的快速发展，人源化抗体和人抗体的出现为临床应用带来了新的希望。
当前正处于临床研究的多种抗体中，嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于70%[14]。
目前的人源化抗体主要用于肿瘤、自身免疫性疾病的治疗以及抗病毒感染等临床治疗。
2.1、在肿瘤治疗方面的应用人源化单克隆抗体的研制的主要任务之一就是治疗肿瘤疾病，人源化抗体药物是针对那些与肿瘤发生、发展相关的靶分子，这些靶分子在正常组织或细胞中就存在一定的表达，但在许多肿瘤细胞中过度表达，因此可作为肿瘤特异的标志物。
如Herceptin是1998年9月被FDA批准上市的人源化IgG1单抗，用于转移性乳腺癌的治疗，其靶向抗原为人类表皮生长因子受体- 2( HER- 2)。
Colomer等[15]试验表明，HER- 2 在乳腺癌细胞表面的过表达与细胞的恶性转化相关，使其成为肿瘤治疗的靶点。