四、影响氨基酸分析的各种因素
样品中氨基酸浓度的影响 缓冲液PH值、钠离子浓度的影响 柱温的影响 氨的影响 氧的影响 光源的影响（钨灯）

（一）样品中氨基酸浓度的影响

每种仪器都有其比较合适的进样量，进 样浓度都有一定的范围。浓度太大太小 都不适宜，尤其是将高浓度的样品注入 仪器中会造成仪器管路的堵塞。最好进 样分析前将样品稀释到比较合适的浓度。

（二）氨基酸分析仪的特点



1、高灵敏度：以蛋白水解液标准为例可检测到 3pmoL。 2、快速、高分辨率：水解氨基酸分析时间只有30 分钟，生理体液110分钟。 3、柱后衍生技术（实时混合）：与氨基酸反应前 才将两种反应液进行实时混合，有效的延长了反 应液的使用期限、且不需要额外的制冷装置存放。 4、氨气排除系统：增加了除氨柱，能很好的排除 氨在分析过程中对基线及峰形的干扰。
蛋白质水解物
生理体液 分离（苏/丝）
检测限量 定量精确度 操作
110min 95-98%
3pmol CV≤1.0% 简单
135min 85%
100pmol CV≤3% 复杂
三、样品的制备
（一）蛋白质的水解 （二）游离氨基酸样品的制备 （三）生理体液样品的前处理

（一）蛋白质的水解
用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在 的都要进行水解处理，水解方法有三种： 1、酸水解法：标准水解法，水解彻底，但色氨酸被 破坏。 2、碱水解法：用NaOH作为水解剂，色氨酸不被破坏， 但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸等被破坏。 3、酶水解法：水解条件温和，无需特殊设备，氨基 酸不受破环，但水解时间长，而且不易水解完全。
氨基酸分析基本 原理与应用
目录
一、氨基酸分析仪 二、基本原理及特点 三、样品的制备 四、影响氨基酸分析的各种因素 五、应用

日立L-8900氨基酸分析仪

（一）氨基酸分析仪的构成
1、输液单元（泵与管路） 2、进样单元（自动进样器） 3、分离单元（离子交换柱、柱温箱） 4、反应单元（反应柱、反应温度加热设备） 5、检测单元（分光光度计） 6、程序控制、数据处理（工作站）
（二）缓冲液PH值与钠离子浓度的影响

色谱图中各种氨基酸分离的特别好而没 有峰丢失，缓冲液的PH值和钠离子起着 重要的作用。如PH值和钠离子浓度不当 会出现氨基酸出峰提前错后以及重叠现 象。
（三）柱温的影响

柱温不稳定或不准确会出现基线漂 移或分离度不好影响分离效果以及 准确定量。
（四）氨的影响

谢谢！
（三）氨基酸分析仪基本分析原理
1、离子交换柱 2、离子交换树脂 3、离子交换原理

1、离子交换柱
氨基酸分析仪的中心部件就是离子交换 柱，主要靠它把具有共性而又有差别的 各种氨基酸混合物分离开来进行定量。 日立氨基酸分析仪交换柱为磺酸型阳离 子树脂分离柱。

2、离子交换树脂
用作氨基酸分离柱的固定相一般都是固体的合成 离子交换剂。一般氨基酸分析仪所用的离子交换 树脂是强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和 二乙烯聚合而成的。作为理想的离子交换剂应符 合下列要求： 机械强度好 不溶解且具有很好的化学稳定性 均匀球状颗粒 当装入柱子后应有良好的通透性 交换容量大 离子交换基应是单一的官能性的
3、离子交换原理
缓冲液（流动相）中的样品离子与离子 交换剂（固定相）间离子交换过程可分 为以下几步： 首先离子通过扩散作用，到达分离柱树 脂的表面。（这个过程进行的非常快） 离子进一步扩散到交换位置以致进入树 脂内部交换位置。这决定于树脂的交联 度和溶液的深度。这个过程是整个离子 交换反应的关键。
二、基本原理

氨基酸
R
H _ C _ COOH
NH2 _
组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外、 都有一个不对称碳原子，即а-碳原子。 а-碳原子有四个不同取代基：羧基、 氨基、氢原子和R基团，不同氨基酸 的R基团不同。 每种氨基酸有D-构型和L-构型，蛋白 质中的氨基酸都是L-构型。
_
（一）氨基酸的分类

缓冲液、样品、流路系统混入氨进 可使基线在碱性氨基酸出峰处将基 线抬高，影响碱性氨基酸分离效果 和准确定量。
（五）氧的影响

反应液中的茚三酮最忌氧，茚三酮氧化 后即变质失效，所以茚三酮购入后一定 要妥善保管，特别是不能在空气中长时 间暴露。缓冲液中的溶解氧也会对茚三 酮显色效果造成影响。
（六）光源的影响
（二）游离氨基酸样品的制备
游离氨基酸的样品在分析前必需进行 磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、 脱色等处理。在进行分析前建议使用 C18小柱处理一下。
（三）生理体液样品的处理
生理体液的样品首先要除去样品中 的蛋白质，获得游离氨基酸。除去 蛋白质化学方法为： 1、苦味酸法 2、三氯乙酸法 3、乙醇沉淀法 4、磺基水杨酸法（常用的方法）
A.
B.
C.
D. E.
在交换位置上进行离子交换，这个平衡是 瞬间的。被交换的离子带的电荷越多，它 与树脂的结合越紧密，被其它离子取代就 越困难。 被交换的离子通过树脂扩散到表面。 用洗脱液洗脱，被交换的离子扩散到溶液 中去。

氨基酸与树脂间的交换主要决定于带有相 反电荷之间的引力作用。阳离子树脂本身 带有负电荷，两者正负吸引而结合，并且 氨基酸所带正电荷越多，结合得越紧密， 被Na离子置换就越困难。所以，碱性氨基 酸结合力最强，其次为芳香族氨基酸、中 性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。

光源不佳时，灵敏度会降低，到达规 定时间后该换就得换灯（使用期限以 灯能量为准）
五、应用

氨基酸是组成蛋白质的基本单元，具有 极其重要的生理功能。氨基酸的检测分 析广泛应用于医学、农业、食品、医药、 饲料、化妆品等与人类生活和健康密切 相关的几大行业。
真伪鉴别
茶氨酸是茶叶的特性氨基酸，所以茶氨酸 的含量与茶叶品质和等级有直接关系。 鱼粉是一种很好的蛋白质饲料。它的氨基 酸组成特点是赖氨酸、蛋氨酸含量高。市 场上的鱼粉各种各样，氨基酸分析结果很 容易就可以区别它的真伪。
它的分类有两种： 1、按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少 分类：中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨 基酸。 2、按人体营养的需求又可分为必需氨基酸、 半必需氨基酸及非必需氨基酸。

（二）氨基酸的化学反应

与茚三酮反应：茚三酮与氨基酸一起加 热，形成深兰紫色复合物，最大吸收波 长为570nm。 茚三酮与羟脯氨酸反应不释放NH3，直 接生成黄色化合物，吸收波长在440nm。

所以，用不同离子强度、PH值的缓冲 液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱 下来，被洗脱下来的氨基酸与茚三酮 反应液在加热条件下反应（135℃）， 生成可在分光光度计中570nm的蓝紫 色物质（仲氨生成浅黄色物质， 440nm检测）外标法定量。
（四）氨基酸分析仪与HPLC法的比较
氨基酸分析仪 30min HPLC 50min