氨基酸背景知识简介
❀ 手性氨基酸
✎ 人们发现组成蛋白质的氨基酸都是α-型氨基酸(即 氨基与羧基旁的碳相连)并且除甘氨酸外,其α-碳原 子都是不对称的,即都具有旋光性(手性),研究表明: 只有L型氨基酸参与蛋白质的组成,故组成蛋白质的 氨基酸,除甘氨酸外都是L-型氨基酸.
氨基酸分析的重要性
❀ 氨基酸是构成蛋白的基本要素
AccQ·Tag的色谱条件
❀ 色谱柱: AccQ-Tag C18, 3.9×150mm
✎ 洗脱剂 A: 140mM 醋酸钠/17mM 三乙胺 pH 5.05 ,用稀H3PO4
✎ 洗脱剂 B: 乙腈 ✎ 洗脱剂 C: 水
❀ 柱温: 37°C
✎ 流速 = 1.0 ml/min ✎ 梯度洗脱
AccQ衍生氨基酸标样的色谱图
分离衍生困难
低 pmole 低 pmole 低 pmole 低 pmole 高 fmole 低 pmole
困难
致癌物质
简单快速
只能用于一级 氨，稳定性差
室 温 反 应 ， 需要液-液萃取
要萃取
除取过量试剂
多步室温反 应
反应步骤多
加热，单步 反应
分离较慢
加 热 ， 多 步 复杂步骤，反
反应
应产物多
Waters氨基酸分析概况
✎ 可测定蛋白分子中各种氨基酸的个数 ✎ 用来做蛋白定量
❀ 关键的代谢介质
✎ 重要的诊断依据 ✎ 营养研究
❀ 营养价值
✎ 动物饲料，宠物食品 ✎ 静脉输液，植物生理 ✎ 婴儿食品
氨基酸定量分析的需求
❀ 为什么要测定浓度？
✎ 营养成分的确定 - 食品、饲料或药物的质量 ✎ 蛋白营养成分的质量或性质 ✎ 计算蛋白的含量 ✎ 测定多肽含量 ✎ 计算蛋白的氨基酸组成，支持序列分析 ✎ 特征活性的测定，用于医院病理分析
❀ 柱前衍生法的分离一般在反相柱(如C18)上完成,而柱后 衍生法的分离一般在阳离子交换柱上进行。柱后法的典 型代表为氨基酸分析仪,而AccQ·Tag为典型的柱前法。
今天还在使用的氨基酸分析技术
❀ 柱后衍生,离子交换法分离,衍生只是显色
✎ Ninhydrin(茚三酮) 或 OPA(邻苯二甲醛)
❀ 柱前衍生,反相分离,衍生同时改变极性和显色
氨基酸分析:样品的来源及种类
❀ 纯的多肽及蛋白
✎ 生物技术，制药，大学及生化实验室
❀ 粗蛋白水解产物
✎ 谷物/农产品，婴儿食品配方 ✎ 体液蛋白水解产物 ✎ 营养研究，质量控制，食品/饲料公司
❀ 体液培养液/发酵液
✎ 过程开发，生产的质量控制 ✎ 生物制药公司
❀ 生理液
✎ 血浆，尿液等 ✎ 生物技术，制药，大学及生化实验室
Waters AccQ·Tag氨基酸分析法
❀ 独特的专利化学品 - 专为氨基酸分析合成 ❀ 完全保证的系统及方法 ❀ 简便易行的样品制备及系统设置 ❀ 稳定的衍生产物 ❀ 广泛适应于不同的样品及样品基质 ❀ 极高的荧光灵敏度，适宜的紫外灵敏度 ❀ 结果重现性及精度最好的氨基酸分析方法
AccQ-Tag:关键的特色及优点
✎ Dansyl Chloride (丹磺酰氯) ✎ Phenylthiohydantoin (PTH,乙内酰苯硫脲) ✎ NBD-Cl (4-氯-7-硝基苯并-2-恶-1,3-二唑) ✎ OPA 或 OPA + FMOC ✎ FMOC(氯甲酸芴甲酯) ✎ PITC(异硫氰酸苯酯,Pico-Tag) ✎ AQC(6-氨基喹啉-N-琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯
Elsden and Synge, Biochem.J., 38,(1948) IX.
氨基酸分析的历史
❀ 1948 - 用柱后茚三酮反应法分离氨基酸, Stein and Moore, J. Biol.Chem., 176, (1948) 337 (被 授予诺贝尔奖)
❀ 1951 - 离子交换--柱后茚三酮法分离氨基酸, Stein and Moore, J. Biol. Chem., 192,(1951) 663.
的分析,如:含磷氨基酸、或氨基糖等 ❀ 通用性强,可用于分析小肽或其它非氨基
酸样品 ❀ 分析速度较快，一般对氨基酸没有破坏
柱前衍生方法的缺点
❀ 某些方法不能衍生所有氨基酸(如OPA) ❀ 某些方法对氨基酸产生非单一衍生产物 ❀ 衍生反应需特定的基质条件，衍生效率
取决于本底 ❀ 对样品制备需要较多的投入 ❀ 有时过量的试剂会影响分离 ❀ 某些技术对仪器及操作人员要求较苛刻
❀ 需要进行处理：“衍生”
✎ 增加显色基团，提高检测灵敏度 ✎ 改变样品的极性，改善分离结果
氨基酸的化学衍生
❀ 所谓化学衍生,就是选取某种化学试剂与氨基酸进行化 学反应,生成一种较易于被检测的新物质。用来与氨基 酸反应的试剂叫衍生试剂,例如： A + R→ D 氨基酸 衍生试剂 衍生产物
❀ 衍生反应可发生在色谱分离之前(柱前衍生),也可发生在 色谱分离之后(柱后衍生).
❀ 操作非常简单
✎ 与1及2级氨基酸形成单一衍生产物 ✎ 反应可在室温下瞬间完成，无需除去过量的衍生剂
❀ 灵敏度极高
✎ 反应产物有极强的荧光 - 检测限：50 ~ 300 fmol ✎ 亦有很强的紫外吸收 - 检测限：0.1 ~ 0.30 pmol
❀ 准确性很高，极好的定量结果
✎ 在一定的pH范围内，衍生产率不受影响 ✎ 常见的盐及洗涤剂不影响衍生反应
选择氨基酸分析方法的策略
氨基酸背景知识简介
❀ 什么是氨基酸?
✎ 从化学角度上讲,氨基酸是在分子结构中既带有氨基 (-NH2)又带有羧基(-COOH)的一类有机化合物。
✎ 从生命科学角度来讲,氨基酸是组成蛋白质的基本单 元.氨基酸通过氨基和羧基形成肽键(酰胺键)相互联 结成多肽和蛋白质。
氨基酸背景知识简介
pH = 5.04 1
2 34 56 7
13 = Tyr 14 = Val 15 = Met 16 = Lys 17 = Ile 18 = Leu
19 = Phe
8 9 10 11
❀ 1958 - 氨基酸自动分析仪 (茚三酮) 问世, Spackman, Stein and Moore, Anal. Chem., 30, (1958)1190
氨基酸分析的特点
❀ 多数氨基酸没有“显色基团”
✎ 无法用简单的方法检测
❀ 所有的氨基酸极性都很大
RCH 2CH ( NH 3 ) + COO −
柱前衍生技术的比较
技术 检测模式 典型检测限 反应条件
限制
Dansyl Chloride
PTH NBD Chloride
OPA
UV 254 荧光 UV 269 荧光
荧光
FMOC
荧光
PITC
UV 254
AQC
UV 248 荧光
OPA/FMOC 荧光
低至中 pmole 困难
分离衍生困难
低至中 pmole 困难
❀ 精确度很高
✎ 除氨基酸衍生物外，无其它干扰杂质生成 ✎ 衍生产物极为稳定，室温下可保存一周
AccQ·Tag 衍生法简介
H O
NO N
１°及２°氨基酸
N
O
半衰期＜1秒
O
AQC衍生试剂
H20 半衰期约15秒
NH2 HO
O
+N +
N O
66--氨氨基基鄝喹啉啉 N-羟基琥珀酰亚胺
CO2
H R1
NN R2
❀ Waters最早使用HPLC进行氨基酸分析 ❀ 开发出第一台全自动的氨基酸分析用
HPLC: Auto-Tag/OPA ❀ 开发出第一个完整的用在HPLC上的氨基
酸分析试剂包
✎ Waters Pico-Tag方法(1984)
❀ 目前性能最好的氨基酸分析方法
✎ Waters AccQ-Tag方法(1993)
氨基酸背景知识简介
❀ 何谓游离氨基酸？
✎ 在哺乳动物体内还有许多氨基酸,如鸟氨酸(Orn),瓜 氨酸(Cit),γ-氨基丁酸(Gaba),牛磺酸(Tau)等等, 这些氨基酸虽然不参与组成蛋白质,但参与体内的代 谢作用,在生命活动中起着重要作用,例如∶Glu,Ser, Gly,Gaba,Tau在生物体内具有神经递质作用,故称为 神经递质氨基酸。
✎ 与蛋白水解氨基酸相对应,通常把这些游离于生物体 内的氨基酸叫作游离氨基酸.
氨基酸背景知识简介
❀ 何谓必需氨基酸？
✎ 有一些氨基酸是人体不能合成或合成量不能满足代 谢需要的,必须从食物中补给,通常称这类氨基酸 为“必需氨基酸”.对于成人而言,必需氨基酸共有8 种,它们是:蛋氨酸,色氨酸,苏氨酸,缬氨酸,异亮氨 酸,赖氨酸,亮氨酸和苯丙氨酸.
✎ 而精氨酸和组氨酸是幼儿所必需的,故称为半必需 氨基酸.
氨基酸背景知识简介
❀ 酸性、碱性和中性氨基酸
✎ 在水溶液中,天冬氨酸和谷氨酸显酸性,称为酸性氨 基酸;精氨酸,赖氨酸,组氨酸显碱性,叫作碱性氨基 酸,其它氨基酸无明显酸碱性,称作中性氨基酸.
❀ 伯、仲氨基酸
✎ 脯氨酸的氨基上只有一个氢,叫二级(仲)氨基酸,其 它19种水解氨基酸的氨基上均有二个氢,叫作一级( 伯)氨基酸.
❀ 何谓通用氨基酸？
✎ 自然界存在的氨基酸约有300多种,但构成天然蛋白质 的氨基酸只有20种.
✎ 这些氨基酸存在于动物,植物和微生物的一切蛋白质 中,因此被称为通用氨基酸.
✎ 它们是:
天门冬氨酸(Asp或D),丝氨酸(Ser或S),谷氨酸(Glu或E),甘氨酸 (Gly或G),组氨酸(His或H),精氨酸(Arg或R),苏氨酸(Thr或 T),丙氨酸(Ala或A),脯氨酸(Pro或P),半胱氨酸(Cys或C),酪氨 酸(Tyr或Y),缬氨酸(Val或V),蛋氨酸(Met或M),赖氨酸(Lys或 K),异亮氨酸(Ile或I),亮氨酸(Leu或L),苯丙氨酸(Phe或F),色 氨酸(Trp或W),天冬酰胺(Asn或N),谷氨酰胺(Gln或Q).