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3.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物 自身不能形成发夹结构。
4.要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3’末 端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构。 5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可 能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物结 合物在Taq DNA聚 合酶的作用下，以 dNTPs为反应原料， 靶序列为模板，按 碱基配对与半保留 复制原理，合成一 条新的与模板 DNA 链。
一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。
首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合物冷
却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火， 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。• 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是 在合适条件下的这种循环的不断重复。
PCR Cycle - Step 1 –
Denature template DNA by heat (95 oC)
TargБайду номын сангаасt Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
1. 引物长度一般以 18 ～ 30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起 引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。
2.解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度 (Ta值) 的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较 高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。 计算 Tm 值的方法很多，简易公式为 Tm=4×(G+C)+2×(A+T) ，适于短于 20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低。 精确的 Tm 计算需要考虑缓冲液的盐离子浓度和引物内部的相邻碱基的 动力学参数。
6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时 引发效率较高，但3’要避免较密的C+C或G+C连排。
7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限 制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等 )，便 于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。
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2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs) dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。
厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使用浓 度为0.2mmol/L左右。
dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应 产量。
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一个
循环需2～4 分钟， 2～3 小时就能将 待扩目的基 因扩增放大 几百万倍。
二、PCR反应体系
1 缓冲液
10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可 能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 厂商一般以25mmol MgCl2+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L 反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异 性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中 游离的Mg2+浓度。
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4、模板
单、双链DNA均可。
一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR 较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模 板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。
第八章
PCR技术及其应用
前言 PCR技术简史 第一节 PCR技术原理和工作方式 第二节 PCR产物的克隆 第三节 PCR扩增未知DNA片段 第四节 与反转录相关的PCR 第五节 PCR产生DNA指纹 第六节 实时定量PCR
本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！
第一节 PCR技术原理和工作方式
PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
不同属性的模板所加的理想的量不同，哺乳动物基因组总DNA、酵母 DNA、细菌DNA、质粒、M13噬菌体作模板时，需要的量分别为1g、 10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
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5、耐热性的DNA聚合酶
dNTPs可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA 聚合酶的活性。
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3、引物 一般溶成10 mol/L的贮存液，使用浓度为0.1-0.5 mol/L。 浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。
PCR引物的设计一般原则