高效液相色谱法同时检测配制酒中9种合成着色剂作者：刘子雄，刘映铄，郑鸿涛来源：《现代食品》 2018年第4期摘要：利用聚酰胺粉吸附原理，对国标方法进行综合改进，建立了同时测定配制酒中柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红（偶氮玉红）和赤藓红9 种合成着色剂的高效液相色谱法。
结果显示：本方法9 种合成着色剂在浓度0.5 ～100 μg/mL 线性关系良好，相关系数R ＞ 0.999 9；样品加标回收率为86.8% ～ 98.5%；相对标准偏差为0.4% ～ 1.3%。
关键词：配制酒；聚酰胺粉；合成着色剂；高效液相色谱法Abstract：According to the principle of the adsorption of the polyamide powder, the national standardmethods were improved synthetically, and the high performance liquid chromatography (HPLC) method wasdeveloped for simultaneous determination of synthetic colorants including Tartrazine, new red ,amaranth,ponceau 4R, sunset yellow, allura red, brilliant blue, azorubin, erythrosine in compound wine. The resultsshowed that the nine kinds of synthetic colorants had good linear relations when the concentration was in therange of 0.5~100 μg/mL and the correlation coefficients were more than 0.999 9. The recovery rates of thesample was from 86.8% to 98.5%, and the relative standard deviation was from 0.4% to 1.3%.Key words：Compound wine；Polyamide powder；Synthetic colorants；High performance liquidchromatography中图分类号：O657.72；TS261.7配制酒是指以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为酒基，以食用动植物、食品添加剂作为呈香、呈味、呈色物质，按一定工艺加工而成，改变了其原酒基风格的饮料酒。
其生产工艺允许添加一定量的着色剂改善其色泽，而合成着色剂因性质稳定，染色效果好，成本低廉易得，用量少等特点受到不少食品企业的青睐。
但是，过量摄入合成着色剂会对人体健康造成一定的危害。
因此，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1] 对允许添加的合成着色剂使用量作了相关规定。
目前，合成着色剂主流检测方法是高效液相色谱法，其中GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》[2] 涉及7 种着色剂的检测，SN/T 1743-2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》[3] 涉及4 种着色剂的检测，共包含9 种合成着色剂，分别为柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红（偶氮玉红）和赤藓红。
GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》中赤藓红的前处理方法与其他着色剂的前处理方法又不同，并不是利用聚酰胺粉吸附原理而是利用液液萃取进行处理，在日常检测工作中，特别是大批量多项目合成着色剂检测工作中，往往造成一个样品多次前处理，分别检测，给日常检测工作带来不便，不仅检测时间大大延长，对检测资源也造成一定的浪费。
以下根据GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》、SN/T 1743-2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》和GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[4] 的要求，参考有关文献[5-7]，再结合日常检测工作的经验，利用聚酰胺粉吸附原理，对配制酒中合成着色剂进行提取和净化，使用高效液相色谱仪和二极管阵列检测器同时进行9 种合成着色剂的检测。
1 实验部分1.1 仪器和试剂仪器：安捷伦1260 高效液相色谱仪，G1315D1260DAD 检测器；Milli-Q Integral 3 System 纯水系统；SSW-600-2S 型电热恒温水槽；SHB- Ⅲ A 循环水式多用真空泵。
试剂：标准物质柠檬黄（纯度95.5%）、新红（纯度89.0%）、苋菜红（纯度92.8%）、胭脂红（纯度98.2%）、日落黄（纯度90.5%）、诱惑红（纯度86.3%）、亮蓝（纯度92.3%）、酸性红（纯度93.5%）、赤藓红（纯度91.0%），均由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供；色谱级甲醇（默克）和乙酸铵（阿拉丁）；分析纯甲醇，甲酸，无水乙醇，氨水，柠檬酸；层析用聚酰胺粉100 ～ 200 目；一级水；配制酒试样，购自超市。
1.2 溶液的配制标准溶液按GB 5009.35-2016 方法要求配制，固体纯品型标准品需根据纯度折算浓度。
pH=5 的甲醇-水（V ∶ V=6 ∶ 4）：量取分析纯甲醇60 mL，纯水40 mL，混匀，然后用甲酸调节pH 到5。
乙醇- 氨水-水（V ∶ V ∶ V=7 ∶ 2 ∶ 1）：量取乙醇70 mL，氨水20 mL，纯水10 mL，混匀。
柠檬酸溶液：称取20 g柠檬酸，加水溶解并稀释至100 mL。
pH=5 的水：水中加柠檬酸溶液调pH 到5。
乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取1.54 g 乙酸铵，加水溶解并稀释至1 000 mL。
1.3 样品前处理称取样品10 g（精确至0.001 g）至200 mL 烧杯中，加水约40 mL 混匀，用pH=5 的水调节pH 至酸性，置于60 ℃电子恒温水浴锅中，加入约1 g 聚酰胺粉，搅拌。
静置至上层水溶液呈无色透明时，趁热将样品溶液倒入G3 垂融漏斗中抽滤，用pH=5 的水洗涤3 次，每次10 mL，然后用pH=5 的甲醇- 水洗涤3 次，每次10 mL，弃洗涤液。
换干净的抽滤瓶，用乙醇- 氨水- 水解吸3 ～ 5 次，每次10 mL，直至色素完全解吸，收集解吸液至200 mL 烧杯中，置于80 ℃电热恒温水槽中浓缩至约2 ～ 3 mL，加水定容至10 mL，经0.45μmPTFE 微孔滤膜过滤，使用高效液相色谱仪分析。
1.4 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipae Plus C18（4.6×250mm 5-Micron）。
流动相：色谱甲醇（A）和0.02 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱，见表1。
流速：1.000 mL/min。
柱温箱温度：35 ℃。
进样量：10 μL。
DAD 检测波长：亮蓝检测波长为575 nm，其他为480 nm（波长变动时间设置为0 ～ 8.20 min，480 nm；8.21 ～ 8.57 min，575 nm；8.58 ～ 10.05 min，480 nm）。
2.1 方法的线性和检出限在设定的色谱条件下，9 种合成着色剂色谱分离情况如图1 所示，线性方程及相关系数见表2。
在本实验条件下，按照信噪比S/N=3 计算检出限，结果见表2。
2.2 方法的准确度方法准确度用样品加标回收率表示，对试样进行3 个浓度水平加标，每个水平进行3 次重复测定，结果见表3。
2.3 方法的精密度方法精密度用相对标准偏差表示，自制含有9 种着色剂的配制酒试样，进行7 次重复测定，计算精密度，结果见表4。
3 讨论3.1 波长的选择GB 5009.35-2016 和SN/T 1743-2006 方法均采用254 nm 作为检测波长，但是在实际检测过程中，特别是基质较复杂的样品，容易造成干扰，出现假阳性，而且亮蓝在254 nm 处响应也较低。
亮蓝波长选择为575 nm，响应明显提高，其他着色剂波长选择为480 nm，基质干扰明显降低。
3.2 淋洗液的选择GB 5009.35-2016 和SN/T 1743-2006 方法均选择甲醇- 甲酸（V ∶ V=6 ∶ 4）作为其中一种淋洗液。
实验发现，由于酸性过强，当以甲醇- 甲酸淋洗吸附有赤藓红的聚酰胺粉后，赤藓红被一并洗脱下来，回收率基本为零。
故本方法对淋洗液进行了优化，把甲醇-甲酸更换成pH=5 的甲醇- 水，赤藓红的回收率显著提高，满足定量要求。
4 结语通过线性、检出限、准确度及精密度等方法确认，本方法符合检验要求，重现性好，结果准确可靠，并且节省了检测时间和资源，可用于配制酒中合成着色剂的定量检测。
参考文献：[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB2760-2014 食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S]. 北京：中国标准出版社，2014.[2] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB5009.35-2016 食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定[S]. 北京：中国标准出版社，2016.[3] 国家质量监督检验检疫总局.GB SN/T 1743-2006食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法[S]. 北京：中国标准出版社，2006.[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T27404-2008 实验室质量控制规范食品理化检测[S].北京：中国标准出版社，2008.[5] 戚荣平，梦琪，桑娴，等. 聚酰胺粉吸附-高效液相色谱法测定蜜饯中合成着色剂[J]. 中国卫生检验杂志，2015，25（10）：1525-1527.[6] 吴晓红，蒋彩云，胡文彦，等. 高效液相色谱法测定配制酒中6 种人工合成色素[J]. 酿酒科技，2014（5）：102-104.[7] 王锋. 超高效液相色谱法测定调味料中新红、酸性红、赤藓红的含量[J]. 上海计量测试，2013（2）：35-40.作者简介：刘子雄（1984—），男，助理工程师；专业方向为食品检验。