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药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(1)
多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用研究
郑小玲， 王知坚， 李珏， 王征南， 洪利娅
（浙江省食品药品检验研究院， 杭州 310004）
摘要 目的： 探索多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用。方法： 从药品微生物实验室 环境中连续 7 个月采样收集获得 248 株细菌和 6 株霉菌， 并对收集的细菌采用全自动微生物生化鉴定 仪 （Vitek 2 Compact） 进行鉴定。根据生化鉴定结果选择在种属分类学上具有代表性的 20 种细菌 （共 28 株） 和 6 株霉菌分别采用一代测序技术 （ABI 3500 测序平台） 和宏基因组测序技术 （Hiseq 2000 测序平台 和 Ion torrent 测序平台） 进行鉴定分析， 相互验证菌株鉴定方法的准确性。结果： 28 株细菌的 16S rDNA 一 代测序鉴定与生化鉴定相比， 属水平分类一致的有 23 株， 种水平分类一致的有 10 株。采用 Hiseq 2000 对 28 株细菌混合进行全基因组测序鉴定获得 78 种菌株信息， 与 16S rDNA 一代测序相比， 种水平一致的有 15 株， 属水平一致的有 2 株， 缺失了 3 株菌的信息， 多出了 61 株菌的信息； 霉菌全基因组测序获得 3 株菌信 息， 与霉菌 LSU rDNA 的一代测序结果相比， 缺失了 3 株菌的信息。采用 Ion torrent 对 28 株菌混合进行 16S rDNA 宏基因组测序鉴定， 获得信息包含 7 科、 10 属和 13 种， 与 16S rDNA 一代测序结果对应的有 11 种， 且 10 种属覆盖了一代测序中的 28 株菌； 霉菌 ITS2 宏基因组测序结果包含 4 属和 3 种， 4 属覆盖了霉菌一代 测序结果中的 6 株菌， 但种水平只有烟曲霉和一代测序结果一致。结论： 新一代宏基因组测序技术及分析 方法需要进一步改进与完善， 才能对环境微生物混合菌株进行快速准确鉴定从而开展建库溯源工作。 关键词： 药品检测环境； 一代测序； 宏基因组测序； 微生物试验环境； 生化鉴定； 高通量测序 中图分类号： R 917 文献标识码： A 文章编号： 0254-1793 （2016） 01-0046-07 doi： 10.16155/j.0254-1793.2016.01.07

1.1 主要仪器 数码摄影生物显微镜 ECLIPSE 50i （日本奥林巴斯公司） ； VITEK 2 Compact 全自动微生 物生化仪 （法国梅里埃公司） ； 全自动革兰氏染色仪 （法国梅里埃公司） ； 梯度 96 孔 Verti PCR 仪 （美国 ABI 公司） ； PowerpacBasic 电泳仪 （美国 Bio-Rad 公 司） ； 3500 MicroSeq 全自动微生物基因分析鉴定系 统 （美国 ABI 公司） 。 1.2 菌 株 来 源 连 续 7 个 月 对 作 者 工 作 的 微 生 物实验室环境中不同部位、 人员及设备材料采用 胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA）平板， 分别通过接触碟 法、 空 气 沉 降 法 及 擦 拭 法 进 行 微 生 物 样 本 采 集， 共 获 得 248 株 细 菌 和 6 株 霉 菌， 划线分离纯化后
identification of environmental microorganisms
Abstract Objective: To explore the application of a variety of sequencing technology in the identification of environmental microorganisms in medicines. Methods: Totally 248 strains of bacteria and 6 strains of fungi were collected from the author’s pharmaceutical microbiology laboratory during consecutive 7 months， and these microorganisms were identified by biochemical identification instrument of Vitek 2 Compact． The representative 20 kinds of bacteria （28 strains） and 6 strains of fungi based on species taxonomy were chosen and identified by first-generation sequencing technology （ABI 3500 sequencer） and metagenomic pyrosequencing （Hiseq 2000 and Ion torrent） respectively to mutually validate the accuracy of strain identification method． Results: The comparison between the identification by 16S rDNA first-generation sequencing and the biochemical identification of 28 strains of bacteria showed that 23 isolates were at a consistent species level and 10 isolates at
第一作者 Tel（ ：0571） 86459427； E-mail： 88920169@
药物分析杂志
Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis

药 物 分 析 杂 志 Chin J Phar来自 Anal 2016,36(1)
Application of a variety of sequencing technology in the
ZHENG Xiao-ling， WANG Zhi-jian， LI Jue， WANG Zheng-nan， HONG Li-ya
（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou 310004， China）
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a consistent genus level.The whole genome sequencing of 28 mixed strains of bacteria were identified by Hiseq 2000， which provided information of 78 species of bacteria． Compared with 16S rDNA first-generation sequencing， 15 isolates at a consistent species level and 2 isolates at a consistent genus level were obtained， 3 isolates were missed and 61 isolates were obtained additionally； 3 isolates were obtained by the whole genome information sequencing and 3 isolates were missed when compared with the result by fungi LSU rDNA firstgeneration of sequencing. The 28 strains of bacteria by Ion torrent were mixed and identified by 16S rDNA metagenomic sequencing， and the information of 7 families， 10 genera and 13 species were obtained． 11 isolates were at a consistent species level and 10 genera covered 28 isolates of first-generation sequencing compared with 16S rDNA first-generation sequencing． Totally 4 genera and 3 species were obtained by metagenomic sequencing of fungi ITS2； 4 genera covered 6 isolates of first-generation fungus sequencing， but only Aspergillus Conclusion: Metagenomic fumigatus was consistent with the first-generation sequencing results on species level． pyrosequencing and analysis methods need further improvement and perfection to accurately identify the mixed strains of environmental microbes rapidly and carry out the construction and traceability of microbe database. Keywords: drug testing environment； first-generation DNA sequencing； metagenomic pyrosequencing； microbiology experiment environment； biochemical identification； high-throughput sequencing 微生物污染是药品生产过程监控及最终产品 质量评估的重要指标， 也是影响药品安全生产的潜 ［1］ 在隐患 。目前药品生产过程中的环境监控以空 气中的浮游菌和沉降菌计数为监测指标， 缺乏对微 ［2］ 生物污染进行溯源和调查的方法 。随着分子生 物学技术的发展， 根据 DNA 序列的差异可进行微生 物鉴定， 该法与传统生化鉴定技术相比更为准确、 快 ［3-4］ 捷 。如细菌中的 16S rDNA 序列和真菌中的 LSU rDNA 序 列 及 ITS 序 列 具 有 高 度 的 保 守 性 和 特 异 性［5-6］ ， 对该序列测序分析后可对微生物进行快速 分类。16S rDNA 测序鉴定微生物一般至属或种水 平［7-8］ ， 但 若 对 微 生 物 污 染 进 行 溯 源 分 析， 需将 微 生 物 鉴 定 至 种 以 下 水 平， 因此需要更精确的 微 生 物 鉴 定 技 术。 基 因 组 重 测 序 是 对 已 知 基 因 组序列的物种进行不同个体的基因组测序， 并在 此 基 础 上 对 个 体 或 群 体 进 行 差 异 性 分 析， 从而 可对同一种属的微生物进行进一步分类及溯源 分 析。 随 着 新 一 代 测 序 技 术 的 发 展， 高通量和 ［ 9-10 ］ 低成本已经成为测序技术的主流 。人们可 将 环 境 中 收 集 的 微 生 物 混 合 后 提 取 总 DNA 进 行 宏 基 组 测 序， 通过序列结果分析快速获得样 品中所有微生物菌株的基因组信息［11］。理论上 根据微生物宏基因组的信息不仅可以对样品中 所 有 的 微 生 物 进 行 种 属 鉴 定， 还可以通过建立 环 境 微 生物基因信息库对污染微生物展开溯源 分析。