细胞融合技术研究进展年级专业课程学生姓名学号指导教师摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。

对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。

关键词：细胞融合;机理;方法;应用细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。

1细胞融合的机理最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。

I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。

病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。

细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。

因此推测细胞融合采用相似的机理。

然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。

2细胞融合的方法2.1生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。

解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。

2.2化学法2.2.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。

盐类融合剂对原生质体的破坏小。

今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

2.2.2高钙和高pH值融合法Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。

Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。

提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法)加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。

此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。

在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。

2.3物理法2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。

该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。

2.3.2激光融合技术1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。

该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。

2.3.3空间细胞融合技术植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低[8]。

在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。

20世纪80年代以来,在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。

2.3.4离子束细胞融合技术。

20世纪80年代证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系,据此原理发展了该技术。

离子束的可操纵性高,可用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的[9]。

该项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量,将是细胞融合研究的一大进步。

2.3.5非对称细胞融合技术。

即利用某种外界因素(如γ射线)辐照某一细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核,并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G,处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体,选择性地使其细胞质失活。

然后融合来自这2个原生质体品系的细胞,实现所需胞质和细胞核基因的优化组合。

实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线X 射线照射为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性[10]。

3细胞融合的应用3.1动物细胞融合技术的应用3.1.1用于研究细胞的核质关系。

Prescott等1972年首先应用离心术结合细胞松弛素B分离哺乳类动物细胞的胞质体获得成功,为研究哺乳类细胞的核质关系、细胞质基因的转移开创了新途径[11]。

3.1.2用于揭示疾病发生的机制。

细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。

Lattanzi等将细胞融合技术与免疫荧光、生化分析、电镜技术相结合,对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究并取得较大的进展[12]。

细胞融合技术与显微技术相结合可以研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系,Aguilar等研究发现,多次跨膜蛋白Prm1在酵母细胞的结合现象中起重要作用,该蛋白缺陷的突变体不能完成质膜之间的识别与融合[13],这有助于了解禽流感病毒的致病机理。

3.1.3用于基因定位研究。

JP2杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与细胞的某一性状表达与否相联系,从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。

1967年Weise等发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,利用这一特点可以对人染色体上的基因进行定位。

3.1.4用于衰老机制研究。

Tam等采用细胞融合的方法在干细胞研究中揭示了衰老的分子机制:衰老是一个可逆的过程,它决定于直接或间接控制端粒长度及端粒酶活性的生物分子之间的平衡作用,通过改变染色质的状态进而进行表观遗传修饰调节基因表达[14]。

3.1.5动物细胞融合用于动物育种动物体细胞融合后,杂种细胞一般难以发育再生为一个个体,但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内,可培育出新的杂种。

3.1.6动物细胞融合用于生产单克隆抗体Zou等应用细胞融合技术和酶连免疫技术成功制备出一种新基因Urg11的抗体[3]。

单抗试剂盒可对一些过敏性疾病查找过敏源(抗原检测),癌症、性病、妊娠、妇女月经排卵等进行早期诊断。

3.1.7动物细胞融合用于细胞疗法SCNT(Somatic cell nu-clear transfer)将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合,融合子进行有丝分裂形成囊胚,囊胚的内细胞团是多能干细胞,对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植,不仅解决了器官和组织来源问题,而且避免了宿主对外来物的免疫排斥。

Lagutina等的研究工作解决了动物体细胞与去核卵细胞融合率低的问题[15]。

3.2植物细胞融合技术的应用3.2.1基础理论研究Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培养体系,增加了不对称杂交属内种间细胞融合率[16]。

可以设想,细胞融合技术改善后,可把人参和冬虫夏草的细胞融合产生新的品种,并具备它们各自特有的药效。

3.2.2改善作物品质杂种优势现象在生物界普遍存在,利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一,即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。

核基因控制的雄性不育的保持系很难解决,而细胞质雄性不育的不育系、恢复系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到。

3.2.3培育抗逆植株Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体体细胞杂种;Bastia等对耐霜冻的野生种和栽培种进行体细胞杂交,获得的所有体细胞杂种都比栽培种亲本耐霜冻,其中有3株比野生种亲本的耐性还高[17]。

3.2.4应用于种质保存和有用物质生产目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体,从而有可能引起细胞遗传性的改变,为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法,还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产[18]。

3.3微生物细胞融合技术的应用微生物细胞融合技术一方面用于生物药品的生产,包括抗生素、生物活性物质、疫苗等;另一方面为发酵工业提供优良菌种,如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。

4目前存在的问题及前景细胞融合的确切机理至今仍不清楚,融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等性状出现,此外,细胞融合也存在伦理方面的问题,如将人的细胞核植入牲畜细胞核内,难免会使牲畜遗传信息传入人的细胞核内,如果用于医疗,将是非常危险的。

任何事物都是一把双刃剑:了解细胞与细胞融合的机理有望对诸如细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释,对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。

人体皮肤细胞与动物卵母细胞融合有望克隆出人类胚胎,用于治疗性克隆研究,获取人类胚胎干细胞,再在体外诱导分化,克隆出人体全身所有组织和器官。

参考文献[1]PILISZEK A,MODLINSKI J A,PYSNIAK K,et al.Foetal fibroblasts introducedto cleavingmouse embryos contribute to full-termdevelopment[J].Reproduc-tion,2007,133(1):207-218. [2]ELIZABETH H CHEN,ERIC N OLSON.Unveilingthe mechanisms ofcel-celfusion[J].Science,2005,308:369-373.[3]ZOUX,LI X,LIUJ,et al.Preparation and characterization of a specific mono-clonal antibodyagainst a new gene product:URG11[J].Hybridoma,2006,25(6):378-381.[4]ALV AREZ D M.Cell fusion:Biological perspectives and potential for regenera-tivemedicine[J].Front Biosci,2007,12:1-12.[5]YANGJ,SHEN M H.Polyethylene glycol-mediated cell fusion[J].MethodsMolBiol,2006,325:59-66.[6]RAMOS C,BONENFANT D,TEISSIEJ.Cell Hybridization by electrofusion onfilters[J].Analytical Biochemistry,2002,302(2):213-219.[7]QIPEIMI N,TODOROV A N,TODOROV A T.Action potentials pass severedearthwormMGAsegments reconnected by laser and electric field pulses[J].Brain Research Bul etin,1995,37(2):189-192.[8]JONGKINDJ F,VISSER P,VERKERK A.Cell Fusion in space:Plasma mem-brane fusionin humanfibroblasts during short termmicrogravity[J].AdvanceinSpace Research,1996,17(6/7):21-25.[9]LIU FENG,WANG YU GANG,XUE JIAN MING.Transmission measurementbased onSTMobservation to detect the penetration depth of low energy heavyIons in botanic samples[J].Radiation Measurements,2003,37(1):9-14.[10]HEIT K,WULJ,LIUS X.Mutagenic ef ects of asingle and an exact numberof alpha particles inmammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:3765-3770.[11]PRESCOTT D M,MYERSOND,W ALLACE J.Enucleation of mammalian cellswithcytochalasin B[J].Exp Cell Res,1972,71(2):480-485.[12]LATTANZI G,MUNTONI F,SABATELLI P,et al.Unusual laminin alpha2 pro-cessinginmyoblasts froma patient with a novel variant of congenital musculardystrophy[J].BiochemBiophys Res Commun,2000,277(3):639-642.[13]AGUILAR P S,ENGEL A,WALTER P.The plasma membrane proteins prm1and fig1ascertainfidelity of membrane fusion during yeast mating[J].Mol BiolCell,2007,18(2):547-556.[14]TAM WL,ANG Y S,LI MB.The molecular basis of ageingin stemcells[J].Mech AgeingDev,2007,128(1):137-148.[15]LAGUTINA I,LAZZARI G,DUCHI R,et parative aspects of somaticcell nuclear transfer with conventional and zona-free method in cattle,horse,pig and sheep[J].Theriogenology,2007,67(1):90-98.[16]Y AMAGISHI H,LANDGREN M,FORSBERGJ,et al.Production of asymmetrichybridsbetween Arabidopsis thaliana and Brassica napus utilizing an efficientprotoplast culture system[J].Epub,2002,104(6/7):959-964.[17]BASTIA T,CAROTENUTO N,BASILE B,et al.Induction of novel organelleDNA variationand transfer of resistance to frost and Verticil ium wilt inSolanum tuberosum through somatic hybridization with IEBN mersoni[J].Euphitica,2000,116:1-10.[18]GIL F,REYTOR E,PEREZ-FILGUEIRA D M,et al.Multi merization of peptideantigens forproduction of stable i mmunogens in transgenic plants[J].JBiotechnol,2007,128(3):512-518.。