秋水仙素诱导月季品种‘月月粉’2n花粉的研究张凡;杨慕菡;巩俊清;冯慧;高述民;周燕【摘要】为获得二倍体古老月季品种‘月月粉’人工诱导2n花粉用于现代月季杂交育种,该研究在了解‘月月粉’花粉母细胞发育过程的基础上,使用秋水仙素注射结合包裹法处理幼嫩花蕾,成功获得了可正常萌发的2n花粉,并通过观察诱导获得的花粉离体及其在雌蕊上的萌发特征,初步评估2n花粉用于杂交育种的性能.结果表明:(1)秋水仙素药棉包裹造成部分花蕾在采粉前死亡,花蕾存活率随秋水仙素浓度提高和处理时间延长均极显著降低.(2)2n花粉诱导率在秋水仙素浓度为2.5、5.0、7.5和10.0 g/L间存在显著差异,但在处理时间为24、48和72 h间无显著差异;最佳诱导处理为5.0 g/L秋水仙素处理24 h,诱导率可达15.83％,该处理获得的2n花粉经亚历山大染色检验活力为27.2％.(3)‘月月粉’花粉母细胞在减数分裂时存在异常落后染色体和平行纺锤体,在四分体时期形成染色体数目加倍的二分体和三分体,最终产生2n花粉.(4)所诱导的2n花粉的体外萌发率和花粉管长度与天然花粉无显著差异,且都可以在母本柱头上萌发并长出花粉管进入子房,表明可用于进一步的杂交育种.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2019(039)004【总页数】10页(P620-629)【关键词】月季;2n花粉;秋水仙素;‘月月粉’;花粉母细胞;花粉萌发【作者】张凡;杨慕菡;巩俊清;冯慧;高述民;周燕【作者单位】北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程试验室,北京100083;北京市园林科学研究院,绿化植物育种北京市重点试验室,北京100102【正文语种】中文【中图分类】Q813.5月季(Rosa chinensis)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物，原产中国，是中国十大名花之一，栽培广泛，在观赏、食用、药用等方面具有重要意义[1]，至今已有3万多个品种。
月季的祖先原始蔷薇属植物倍性不稳定，从二倍体到八倍体均有分布。
现代月季经历了漫长的育种过程，具有高度杂合的遗传特点[2]，育种者以花色、花香、无刺、抗病、抗逆等目标，通过杂交、芽变、诱变、分子等育种手段，培养了大量新品种。
杂交育种经过漫长的发展历史，创造了非常庞大的月季种群，并且至今仍在月季育种中占据主要地位[3]。
月季杂交育种的主要困难是，传统品种间的杂交遗传背景较窄，经过长期的育种历程对遗传资源的利用趋于饱和；远缘杂交可使不同物种或亲缘较远的品种间的遗传信息流动起来，但远缘杂交常常存在亲和性低、可育性差等问题[4-5]。
中国在月季栽培上虽然具有悠久的历史，但现代月季育种与国际领先水平仍有较大差距，到2016年，国际上月季登录品种中，中国月季新品种数量仅占4%[1]。
‘月月粉’(‘Old Blush’，2n=2x=14)是二倍体中国古老月季品种，具有连续开花等优良性状，于1793年引进英国，改变了欧洲月季只有夏季开花的局面。
然而，由于现代观赏月季大多为四倍体，二倍体月季与其杂交亲和性较差，或产生的三倍体后代经常不育，阻碍了育种工作[6-7]。
2n花粉是月季多倍体形成的主要途径，可使二倍体月季品种作为父本与四倍体月季母本的杂交中产生可育后代，是解决不育问题的可行之策[8-9]。
天然2n花粉产生多与环境因素尤其是温度有关，温度异常升高或降低均会提高2n花粉的发生率，这种产生途径依赖环境的偶然性，具有不稳定的年际变化[10-11]，故有必要通过人工诱导来稳定高效地获得2n花粉。
月季多倍体育种多报道温室栽培30 ℃以上的高温导致月季2n花粉产生率提高，32.7 ℃可导致‘Hw336’2n花粉产生率从0.1%提高到4.7%，并可获得四倍体后代[12]，而36 ℃导致二倍体月季2n花粉产生率从0.2%提高到24.5%，但2n花粉萌发孔和表面纹饰均观察到明显的畸形[11]。
除此之外，化学诱变可成功诱导月季体细胞加倍获得同源多倍体，如使用黄草消诱变二倍体月季茎段获得了44.4%的同源四倍体[13]，以及使用黄草消、氟乐灵、APM诱导3个月季品种最高达到了66.7%的诱导率[14]，但同源多倍体由于未经历重复基因组的整合，在杂交中经常出现不育，并且同源四倍体仅仅是二倍体的简单加倍，而发生在第一次减数分裂时加倍的2n花粉(FDR型，First division restitution)则可继承其父母本80%左右的杂合度[8]，因此具有更高的利用价值。
月季2n花粉的化学诱导尚未见报道，但许多园艺植物在近些年逐渐开展了2n花粉在杂交中的相关研究，以及秋水仙素等微管抑制剂人工诱导2n花粉的工作，在秋海棠(Begonia sp.)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、郁金香(Tulipa sp.)、百合(Lilium sp.)等众多物种上获得进展[15-19]，可以作为本研究的参考。
本研究以中国古老月季‘月月粉’为材料，在了解其花粉发育和2n花粉产生的基础上，使用秋水仙素诱导提高2n花粉的产生率，并通过观察诱导获得花粉离体和在雌蕊上的萌发从而初步评估2n花粉用于杂交育种的性能，进而促进‘月月粉’遗传资源利用效率的提高。
1 材料和方法1.1 植物材料试验所用所有月季均来自北京市园林科学研究院，试验于2015年12月到2018年4月进行。
花粉母细胞(pollen mother cell, PMC)发育观察与秋水仙素诱导所用花粉材料均来自多年生‘月月粉’，采集于每年4～5月间，杂交授粉的母本是四倍体现代月季‘桔红色火焰’(‘Orange Fire’)。
1.2 诱导时期的确定在不同植株上采集不同大小的花蕾共30个，测量长宽并从小到大编号，采用普通压片法醋酸洋红染色观察花粉发育时期，每个花蕾观察3个花药，共观察至少200个PMC并选形态清晰典型者拍照，确定PMC减数分裂的过程以及与花蕾大小的关系。
1.3 2n花粉的人工诱导诱导试验于2017年4月中旬至5月底进行，日温22 ℃～29 ℃，夜温7 ℃～14 ℃。
诱导‘月月粉’秋水仙素浓度设计为2.5、5.0、7.5和10.0 g/L 4个梯度；对照为蒸馏水即0 g/L和无处理，处理时间为24、48和72 h，每个组合处理20个花蕾。
使用一次性注射器刺穿花瓣伸入到花蕾中心位置，注射相应浓度的秋水仙素溶液至萼片缝隙有液滴渗出，立即用浸满相同浓度秋水仙素的脱脂棉包裹花蕾，使用封口膜在外层扎紧。
待处理完成后，去掉脱脂棉并挂牌，正常栽培管理，1周后统计不同处理花蕾的存活率。
约2周后，剩余存活的花蕾生长到适宜采粉的时期，收集花粉，统计不同处理的2n花粉诱导率与花粉活力(亚历山大染色法)，综合评价筛选出效果最好的浓度和处理时间。
1.4 减数分裂异常现象的观察与2n花粉产生比例预测观察前期Ⅰ-末期Ⅱ的PMC，寻找可能造成减数分裂异常的染色体现象，如染色体桥、平行纺锤体、落后染色体。
使用诱导效率最高的组合处理花蕾，处理后直接采下花蕾进行压片观察，统计四分体时期二分体(Dy)、三分体(Tri)、四分体(Te)的数量，由此预测2n花粉的产生比例=(2Dy+Tri)/(4Te+3T ri+2Dy)×100%。
1.5 诱导花粉的萌发参考丁一鸣[20]的方法，以蔗糖、硼酸、氯化钙配制花粉体外萌发培养基，蔗糖浓度经筛选定为10%。
室温(20 ℃)下避光培养6 h后，显微镜下观察统计萌发的花粉，统计萌发率并测量花粉管平均长度。
将天然花粉和诱导花粉分别在去雄的母本‘桔红色火焰’雌蕊上授粉并套袋保护，采集授粉后4 h、24 h和72 h的母本花蕾，参考周旭红等的方法[21]，用苯胺蓝染色法在荧光显微镜(Leica DM 6000B)下观察不同倍性的花粉在柱头上的萌发。
2 结果与分析2.1 减数分裂进程与花蕾形态的关系‘月月粉’在现蕾的同时开始花粉母细胞(PMC)的发育，按照减数分裂进程可分为5个时期，花蕾长、宽在时期1～4均呈显著差异(表1，图版Ⅰ，A)。
在蕾期1幼嫩的花蕾被嫩叶和萼片紧密包裹，此时PMC还未开始减数分裂，呈现多边形且有核仁(图版Ⅰ，B)。
蕾期2花蕾呈笔尖形， PMC处于减数分裂前期Ⅰ，此时核仁消失出现染色体和纺锤体，并有7对染色体两两配对的联会现象(图版Ⅰ，C, G)。
蕾期3子房明显可见，花柄开始长出腺毛，PMC处于中期Ⅰ～末期Ⅰ(图版Ⅰ，D, H～J)。
蕾期4大部分细胞处于前期Ⅱ～末期Ⅱ，另有少量细胞仍未完成减数分裂Ⅰ(图版Ⅰ，E, K～M)；蕾期5 PMC完成减数分裂，大部分细胞均为四分体(图版Ⅰ，F, N)，子房和花被饱满，花蕾开始泛红。
‘月月粉’同一花药内的PMC的发育存在不同步性，参考前人研究将诱导处理时期定为蕾期2，此时大部分细胞处于前期Ⅰ。
2.2 秋水仙素人工诱导2n花粉2.2.1 秋水仙素处理‘月月粉’花蕾的存活率去掉药棉之后约2周，花蕾生长至可采粉的时期，注射溶剂(蒸馏水)的对照组大部分均可正常生长发育，表明该处理对花蕾造成的损伤不会引起花蕾的大量死亡(图Ⅱ，B)，注射秋水仙素的花蕾多呈现萼片萎缩末端干枯，花瓣畸形的状态，采粉量也极大降低，表明了秋水仙素对花蕾的毒害作用(图Ⅱ，C)，而受秋水仙素毒害严重的花蕾在生长过程中即会脱落，不同处理具有不同的存活率(表2)。
注射蒸馏水在包裹24 h和48 h存活率均为100.0%，在72 h存活率下降到85.0%，说明注射操作不会影响花蕾存活，但湿棉包裹时间过长则会导致花蕾死亡。
随着秋水仙素浓度提高和处理时间延长，花蕾的存活率均呈现降低的趋势，双因素方差分析表明，花蕾存活率在不同浓度和不同处理时间均存在极显著差异(表3)。
表1 ‘月月粉’PMC减数分裂时期与花蕾形态特征的关系Tabel 1 The relation between the interprocess of meiosis and the morphological characteristics of flower buds in ‘Old Blush’编号No.减数分裂时期Meiosis phase花蕾长Bud length/mm花蕾宽 Bud width/mm长/宽Length/Width1分裂间期Interphase 5.84±0.41d3.24±0.11e0.55±0.02a2前期Ⅰ Prophase Ⅰ7.76±0.74c4.24±0.04d0.54±0.05a3中期Ⅰ-末期Ⅰ Metaphase Ⅰ- TelophaseⅠ10.12±0.64b5.28±0.09c0.52±0.02b4前期Ⅱ-末期Ⅱ Prophase Ⅱ-Telophase Ⅱ13.26±0.56a6.28±0.08b0.47±0.01b5四分体Tetrad13.45±0.68a7.13±0.17a0.53±0.01a注：同列内不同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异显著Note: Different normal letters within column are significant by Duncan’s multiple range test at 0.05 level2.2.2 秋水仙素处理‘月月粉’花蕾的诱导率使用亚历山大法对诱导后的花粉染色，可观察到直径是1n花粉1.3倍以上的大花粉即2n花粉，其中红色近圆形的有活力，无色空瘪的无活力(图Ⅱ,D～F)。