3. T4 DNA聚合酶的“取代合成”法末端标记
四.T7 DNA聚合酶
1. T7 DNA聚合酶特点
活性：
5’3’聚合高！
5’3’外切无
3’5’外切高
2. T7 DNA聚合酶的应用
合成：高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响
标记：类似T4（取代合成）
末端补平：类似T4
第六节核酸修饰酶
一.修饰的T7 DNA聚合酶
(2)原理：电泳分离RNA，并将之转至尼龙膜上（blot)，以标记好的探针（DNA）与之杂交。
实验过程基本上同Southern
Southern blot和Northern blot区别：
1）RNA分子较小，不需进行限制性内切酶切割；
2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团；
第一步：制胶
第二步：样品制备
第三步：点样
第四步：跑电泳
第五步：紫外灯下检测，拍照
第六步：数据处理
缓冲体系：
TAE, pH 8.0, ~50 mM- Tris, Acetate, EDTA
TBE, pH 8.0, ~50 mM- Tris, Borate, EDTA
影响迁移率的因素：
凝胶的孔径
电压
DNA片段长度及结构
活性：
5’3’聚合更高(*3)！
5’3’外切无
3’5’外切无！
修饰的T7 DNA聚合酶的应用：
合成能力：更高、更快、更强！
标记：重在“掺”与
末端补平：
二.激酶(kinase) &磷酸酶(phosphotase)
T4多核苷酸激酶
(1)特点
来源：T4噬菌体pseT基因编码；
活性：5’-OH加磷酸；
(2)T4 kinase5’末端标记的机理
一次RPA就能完成10多次Northern Blot的工作，加快研究速度。
用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5‘OH基国暴露，同多核苷酸激酶从r-P ATP分子中转移来的r-P基团键合，实现末端标记。
(3) T4多核苷酸激酶的应用
a:5’末端标记
b:5’末端磷酸化
磷酸酶
(1)特点
来源：细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphotase，BAP)，E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（Calf intestinal Alkaline Phosphotase, CIAP)，小牛肠。
3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱；
4）在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；
5）操作均应避免RNase的污染。
(2) Ribonuclease protection assay过程：
RNA和探针在液体混合物中杂交.
未杂交上的RNA和探针被核酸酶降解，这种核酸酶只识别单链RNA。
活性：
5’3’聚合低
5’3’外切无！
3’5’外切低
2.Klenow片段的应用
末端补平
末端标记及随机引物标 DNA聚合酶
1. T4 DNA聚合酶特点
活性：
5’3’聚合低
5’3’外切无
3’5’外切高！
2.T4 DNA聚合酶活性的条件
模版、引物、原料dNTP
(2)用途
形成DNA／DNA(DNA／RNA)杂种分子，可以用来
a.检测特定生物体之间的亲缘关系。
b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。c.对目的基因进 Nhomakorabea相对定量。
d.对特定蛋白质进行定性及定量分析
(3)杂交的基本步骤
以核酸分子杂交为例：
凝胶电泳分离的DNA/RNA
吸印,转膜(通过毛细管作用或电导作用)
来源：E.coli
适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端）
2. T4 ligase
来源：T4 phage
适用：粘性末端及平末端
T4 vs. E.coli
T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！
五.Ligase的反应温度
最佳温度：
界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。
5、反转录酶等。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
DNA聚合酶Ⅰ特点
活性：5’3’聚合低
5’3’外切有
3’5’外切低
DNA聚合酶Ⅰ的应用——放射性探针的标记
(1)DNA聚合酶Ⅰ的两种特殊反应：
切口转移与链取代
(2)切口转移法制备放射性DNA分子杂交探针
二、Klenow片段
1、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段
探针标记
杂交
检测
(4).种类
Southern: DNA-DNA
Northern: DNA-RNA
Western: Pr-Pr
二. Southern blotting
1.Southern Blotting
(1)目的：检测特定DNA序列。
(2)原理：电泳分离DNA，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（DNA）与之杂交。
1、电泳
2、分子杂交
3、转化与转染
4、核酸测序
5、DNA扩增---PCR
6、核酸-蛋白相互作用
第一节电泳
原理：通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中运动。
目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同的分子（依据不同的凝胶体系）。
电泳的分类：
琼脂糖凝胶电泳（agarosegel electrophoresis），
(2) S1核酸酶的应用----RNA分子的定位
2.Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的三种活性：
（1）单链核酸内切
（2）双链核酸外切
（3）双链切口对应链
Bal31核酸酶主要用途：
（1）诱发DNA发生缺失突变
（2）定位测定DNA片断中限制性位点的分布
（3）研究超盘旋DNA分子的二级结构
3.其他核酸酶
外切核酸酶Ⅲ（ExonucleaseⅢ）：3’至5’外切
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）
琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）
ds-DNA
目的：
分离不同长度的DNA片段
a.确定DNA片段的长度
b.确定DNA的有无与多少
c.分析酶切产物
凝胶电泳的原理:略
电泳步骤
热稳定性（65℃）BAP：activeCIAP：30min失活
第七节核酸外切酶
1.核酸外（Exonucleases）切酶
定义:一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核苷酸的酶。
分类：单链的核酸外切酶
双链的核酸外切酶
第八节核酸内切酶
1. S1核酸酶
(1)特点：
活性：降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区
（2）菌落与噬菌斑杂交
(1) Dot blotting, slot blottlng:
将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂交检测。多用于病原体基因检测，如微生物的基因。
(2)菌落与噬菌斑杂交（过程略）
三. Northern blotting
1.Northern Blotting
(1)目的：检测特定序列的RNA的长度与丰度。
c:获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。
缺点：
当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。
需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。
4.平末端连接
---衔接物连接法与接头连接法
(1)平末端的衔接物连接法
衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。
EB的影响
分辨率影响因素：
琼脂糖浓度
缓冲液或样品的盐离子浓度
核酸上样量
电压
聚丙烯酰胺凝胶电泳（poly-acrylamide gel electrophoresis，PAGE）
范围：短片段分辨率：1bp
类型：
变性胶（长度）、
非变性胶（长度、构型）
变性胶：1、含尿素；2、DNA样品经甲酰胺与热处理；3、电泳保持温度。
(2)平末端的接头连接法
将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。
七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌
热稳定的DNA连接酶的应用：
寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA）
(3)步骤Protocols
a.基因组DNA制备
b.DNA酶切消化
c.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断
d.碱变性，中和
e.转移DNA到固相支持物(如，尼龙膜)
f.杂交反应
g.放射自显影
h.数据分析
2. Other DNA analyses
（1）斑点杂交(dot blotting)与狭线杂交(slot blotting)
活性：5’-P去磷酸
(2)磷酸酶作用机理
催化核酸分子脱掉5‘－P，使DNA分子5’－P转化成5‘－OH－－－脱磷酸作用。
这样产生的5‘－OH末端，为随后在[r-P]ATP和T4多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。
(3)磷酸酶的应用
末端标记前处理
防止DNA分子自身环化
(4) BAP与CIAP比较
连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR）