DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
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λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
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三、位点特异重组，即特异位点间 发生的整合
➢ 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异 位点间发生的整合。
内切酶
(recBCD)
5´ 3´
3´ 5´
DNA 连接酶
5´ 3´
3´
3´ 5´
5´
3´
5´
5´
3´
3´
3´
Holiday中间体
目录
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
5´
3´
5´
3´
5´ 分支迁移 3´
3´
5´ (recA) 3´
5´
3´
5´
内切酶
(recBCD)
生物化学考试前答疑 时间：本周四、周五进行。 地点：生化楼 具体安排请到生化楼看通知。
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第21章
DNA重组和重组DNA 技术
DNA Recombination and Recombinant DNA Technology
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第一节
自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的
DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature
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由转座子介导的转座
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第二节
重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆
DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone
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一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
➢ 克隆(clone):源于希腊文klone，原意是指以 无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物。
➢ 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
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➢DNA克隆的基本要素 ➢ 工具酶 ➢ 目的DNA片段 ➢ 载体DNA ➢ 宿主细胞
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重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
5´
3´
3´
5´
5´
3´
二、细菌的基因转移与重组有四种方式
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互 接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接 合作用(conjugation)。
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➢ 质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。
➢ 可接合质粒如 F 因子(F factor)
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
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➢ 同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
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（一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染 色体的特异靶位点发生选择性整合；
细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点 (attP) 都含有相同的核心序列，称为O区， 该区由15bp组成：
5’GCTTTTTTATACTAA3’ 3’CGAAAAAATATGATT5’
目录
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反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转 录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。
➢ 通过分支移动产生异源双链DNA；
5´
3´
5´
3´
3´
5´ 分支迁移 3´
5´
3´
5´ (recA) 3´
5´
5´
3´
5´
3´
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➢ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
• 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 • 特有的正向重复序列 • 一个转座酶（transposase)编码基因
IR Transposase Gene IR
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➢插入序列发生转座的形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)
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Ⅱ型限制酶只具有认知切割的作用。所认 知的位置多为短的回文序列；所剪切的碱 基序列通常即为所认知的序列。
Ⅲ型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修 饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列， 切割位与认知序列约距24-26个碱基对。
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➢ 生理意义： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
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（二）细菌的特异位点重组
沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
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➢ hix为反向重复序列，它们之间的H片段 可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。 H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基 因 表 达 ， 另 一 正 向 时 驱 动 H2 和 rH1 基 因 表 达 ， 反 向 ( 倒 位 ) 时 H2 和 rH1 不 表 达 。 rH1为H1的阻遏蛋白基因。
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
➢ 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
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➢同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
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DNA的特性：保守性，变异性，流动性 DNA重组是指不同的DNA分子断裂并连接，从
而产生DNA片段的交换并构成新的DNA分子的 过程。
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DNA重组 同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition)
➢ 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机 制的Holliday模型。
目录
Holliday模型的4个关键步骤： ➢ 两个同源染色体DNA排列整齐； ➢ 一个DNA的一条链断裂；
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
3´ 5´ 5´
3´ 5´ 3´
目录
目录
沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变
DNA
启动序列
启动序列
hin
H2
I
H1
Hin重组酶
H2鞭毛素 阻遏蛋白
hin
H2
I
转位片段
H1
H1鞭毛素
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（三）免疫球蛋白基因的重排
➢ 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链 (H链)组成，分别由三个独立的基因族编码， 其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。
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一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重 组（general recombination）。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接， 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双 链片段的交换。
轻链的基因片段：
L
V
J
C
重链的基因片段：
L
V
D
J
C
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CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC
TGTTTTTGG
基因片段
重组信号序列
➢ 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片 段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧 均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基 因rag (recombination activating gene)共有 两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。