一、项目名称
脐带间充质干细胞治疗肝、肺和神经损伤及其分子机制
二、申报奖种
山东省科技进步奖
三、推荐单位
山东大学
四、项目简介
本项目采用人脐带间充质干细胞（UC-MSC），静脉输注治疗肝硬化、急性肺损伤和缺氧缺血性脑病（HIBD）三种疾病模型，探讨UC-MSC的免疫调控能力和组织修复能力在这些疾病的治疗中所发挥的作用及主要的细胞内调控分子机制。
项目所采用的主要方法：①从人脐带的血管外下层分离培养UC-MSC，进行形态学观察、流式细胞术鉴定其细胞表型，检测分化能力，比较抑制外周血淋巴细胞增殖的能力。
②利用皮下注射四氯化碳方法建立大鼠肝硬化动物模型，将人UC-MSC静脉注射治疗。
③改良Rice法制作新生鼠HIBD模型。
观察大鼠行为学改变，采用Bederson评分进行功能评分等级，在立体定向引导下，向大鼠脑组织内匀速注射等量的PD-MSCs、成纤维细胞。
评价大鼠的认知功能。
细胞治疗后5d，检测外周血免疫指标和海马组织病理指标及HO-1、Nrf2表达情况。
④选择SD大鼠按照10mg/kg体重腹腔内注射LPS，制造脓毒症急性肺损伤模型，UC-MSCs 输注治疗肺损伤：LPS注射致肺损伤1小时后，MSC+LPS组尾静脉注射含5×10^5 个UC-MSC，并进行常规病理切片、支气管肺泡灌洗液、肺湿干比和血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析。
主要实验结果：①细胞表型检测和诱导分化实验证明，我们从脐带中培养得到的贴壁细胞表型符合间充质细胞特征，这些细胞均能够表达例如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和 CD166等特征表面分子，同时不表达造血和内皮细胞标志如CD14、CD31、CD34和CD45分子。
在合适的体外诱导条件下，
在体外培养中向造骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化，UC-MSCs的生长速率比BM-MSCs略高，但BM-MSCs较UC-MSCs具有更多的抑制免疫细胞增殖的能力。
在UC-MSC中上调的表达基因主要涉及器官的生长发育和细胞分化，在经过低剂量IFN-γ处理后免疫调控能力上调。
经过低剂量TGF-β1处理后UC-MSC表达更多的纤连蛋白。
②利用四氯化碳法成功建立了大鼠肝硬化模型，且UC-MSC治疗可以显著地改善肝损伤。
芯片分析结果显示与对照组相比，UC-MSC治疗上调了补体凝血相关基因，下调细胞增殖、细胞周期和胶原合成等相关基因。
其中NAT8酶在MSC介导的肝细胞抗损伤修复中发挥重要作用。
在体外培养的肝细胞株L02实验中，MSC条件上清可显著改善双氧水引起的细胞凋亡，上调NAT8酶可以减少双氧水引起的细胞凋亡，而下调NAT8酶则加剧了细胞凋亡。
③UC-MSCs干预不但能改善HIBD大鼠近期的神经运动功能，而且能远期改善HIBD大鼠的学习记忆功能。
UC-MSCs可通过调节Th17/Treg细胞失衡治疗HIBD，UC-MSCs可通过上调Keap1-Nrf2/ ARE/ HO-1通路治疗HIBD。
④脐带间充质干细胞治疗后肺组织均较单纯LPS损伤组明显减轻。
LPS引起支气管肺泡灌洗液蛋白浓度迅速升高，UC-MSC治疗组在各时间点灌洗液蛋白浓度均有降低，并明显降低了LPS诱发的全身炎症反应，血浆中的促炎因子浓度TNF-α、IL-1β、IL-6在治疗后6小时即明显下降，在此后的24和48小时均低于LPS损伤组。
UC-MSC治疗后HO-1表达进一步增强。
HO-1活性水平与此相似。
UC-MSC治疗组48小时生存率明显高于单纯损伤组，分别为87%和60%，治疗组大鼠生存率提高了20%。
结论：UC-MSC可有效治疗肝硬化、急性肺损伤和缺氧缺血性脑病，其中免疫调控能力在MSC介导的组织抗损伤修复中发挥重要作用。
该项目可以转让，用于公司细胞产品制备或治疗技术推广。
五、应用情况、经济和社会效益
干细胞治疗具有靶向性高和副作用低的特点，代表了绿色医疗的发展方向，其中以脐带间充质干细胞为代表的成体干细胞在临床和科研领域有广泛的应用。
脐带间充质干细胞具有多向分化能力，无病毒污染。
能分泌多种生长因子，在促进细胞生长、抗凋亡和修复中发挥重要作用。
并且具有免疫调节功能，可抑制紊乱的免疫，增强正常骨髓造血.
该项目所进行的脐带间充质干细胞治疗肝硬化、肺损伤和神经损伤，显示了这种多能干细胞在修复凋亡肝细胞、损伤的肺上皮细胞和神经细胞中有不可替代的效果，具有实际的临床应用价值和积极的治疗效果，我们在3家干细胞公司和2家医院合作推广了该项目技术后，在脐带间充质干细胞的社会化储存、临床病理进程诊断和临床应用质量务中积极进行了市场推广，创造了积极的经济效益和社会效益，为济南市创造了多个就业岗位，我们将继续努力，今后将在脐带间充质干细胞在治疗以上三类疾病的临床应用方面进一步加以推进。
六、曾获科技奖励情况
无
七、主要知识产权证明目录
无
八、主要完成人情况表
1、姓名：鞠秀丽排名：1/8 技术职称：主任医师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：设计与组织了该项目，在取材、细胞培养等环节，创造性的发明了无血清培养体系，消除了动物蛋白和内毒素污染；在细胞治疗动物模型领域，最先提出并验证了细胞治疗方案，并就细胞疗效评估体系提出了建设性意见。
作为通讯作者，组织和撰写了12篇相关中英文论文。
曾获省级以上科技奖励情况：2010年获省科技进步二等奖。
2、姓名：李栋排名：2/8 技术职称：副主任技师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在细胞培养、细胞鉴定和细胞内所涉及的分子信号通
路分析中发挥主要作用，在脐带间充质干细胞治疗肺损伤的评价和疗效评估中发挥关键作用，以第一作者或通讯作者发表论文4篇。
曾获省级以上科技奖励情况：无。
3、姓名：时庆排名：3/8 技术职称：主管技师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在本项目中主要负责疾病动物模型的制备，在脑缺氧大鼠新生鼠、肺损伤大鼠制备、和肝硬化大鼠制备中发挥主要作用，对疾病大鼠模型的评价和病理评分发挥主要作用，参与发表论文10余篇。
曾获省级以上科技奖励情况：无。
4、姓名：庄泳排名：4/8 技术职称：主治医师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在配制无血清培养基用于脐带间充质干细胞的扩增中做出了突出贡献，选择了最佳的生长因子配比，并对干细胞的生长、体外分化和鉴定做出了关键贡献。
曾获省级以上科技奖励情况：无。
5、姓名：付金秋排名：5/8 技术职称：主治医师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在脐带间充质干细胞治疗肝硬化中发挥关键作用，发现了NAT8酶在治疗肝硬化中的重要意义，并创建了干细胞治疗肝硬化的治疗方案和评价体系。
曾获省级以上科技奖励情况：2010年获省科技进步二等奖。
6、姓名：李建军排名：6/8 技术职称：主任医师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在脐带间充质干细胞治疗肺损伤中做出创造性贡献，在治疗方案、疗效评价和数据处理中做出大量突出贡献，另外在大鼠模型等构建
中建立了稳定的麻醉体系，降低了动物死亡率。
曾获省级以上科技奖励情况：无
7、姓名：赵洁排名：7/8 技术职称：主治医师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在治疗前脐带间充质干细胞的预处理中做出创造性贡献，降低了细胞植入后的死亡率，提高了治疗效果。
曾获省级以上科技奖励情况：无
8、姓名：蔡直锋排名：8/8 技术职称：主治医师
工作单位：山东大学齐鲁医院
对本项目技术创造性贡献：在脐带间充质干细胞的最佳培养体系的确定中发挥关键作用。
曾获省级以上科技奖励情况：无
九、主要完成单位情况表
1、山东大学齐鲁医院排名：1/1
山东大学齐鲁医院主要从硬件/软件和人才建设等领域对该项目的顺利完成做出了贡献。
本项目主要完成实验室低温医学研究室由山东大学齐鲁医院于上世纪八十年代初组建，我院分配于该实验室近300平米的实验科研用地，陆续投入各类专业仪器设备近1000万元并不断维护与更新。
该项目顺利实施所需的动物实验室、细胞培养百级层流间和分子生物学实验室，均由齐鲁医院提供。
另外齐鲁医院还为该项目提供了全部仪器设备，包括流式细胞仪、荧光倒置显微镜、定量PCR仪、程控降温仪、大容量水平低速恒温离心机和高速离心机等，这些仪器均由医院委派的专人管理并定期维护，维持了高水平的仪器稳定工作状态。
本项目组全体成员均为我院正式编制员工，齐鲁医院所拥有的稳定的人才引
进制度、后勤保障体系是项目组成员能够团结协作勤奋工作的基础。
齐鲁医院科研管理机构定期举办基金申请讲座、学术前沿讲座也为研究生的培养构建了良好的体系。