地中海贫血的诊断方法 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
地中海贫血的诊断方法
B-地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查，方法主要有：
1 血常规检测
地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，如MCV≤80 fl，MCH≤25．0 Pg，则可疑为地中海贫血患者或基因携带者，可同时测定血清铁和铁蛋白，以排除缺铁性贫血。
2 红细胞渗透脆性试验(一管法)
其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在0．32％(或0．36％)NaC1中溶解度降低(脆性降低)。
一管法可用于地中海贫血群体筛查。
3 血红蛋白(Hb)电泳Hb电泳
是检测地中海贫血、异常血红蛋白最常用的方法，可观察到HbE、HbH等异常血红蛋白区带，同时可定量检测HbF、HbA2的含量并区分常见类型的地中海贫血。
有研究显示MCV、Hb电泳和红细胞脆性实验三者联合检测的灵敏度可达100％，阴性预告值达100％，联合特异度可达100％，阳性预告值达100％DS。
4 高效液相色谱技术(HPLC)
原理：采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术，全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型，容易发现重型和轻型B地中海贫血。
在操作上，HPLC采用的是全血标本，不需要制备Hb液，只要
将全血标本直接放在仪器上，通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。
优点：所需样本量少，自动化程度高，操作简单，快速，能消除人为误差，结果准确。
HPLC也可用于胎儿脐带血的产前诊断，可诊断出重型B地中海贫血，但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿。
近年来，地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测。
5 基因诊断
近年来，随着分子生物学研究领域的不断发展，从最初的B珠蛋白基因簇限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR)技术结合其他分子生物学方法，B地中海贫血的诊断已逐步改进和完善。
基因诊断方法有下列几种：
5．1 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析)
原理：DNA限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸序列，得到一定长度的DNA片段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成，从而改变酶切片段的大小。
突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可判断出突变是否存在。
缺点：由于单独使用该方法，不能直接测出受试者突变基因的类型，必须结合寡核苷酸探针等技术，故其应用范围有一定限制，且操作繁琐。
如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子，无法用此方法进行产前诊断，或者患儿和父母所有位点上都是杂合状态，只能进行50％的排除性诊断。
5．2 探针斑点杂交技术(allele—specific oligonucleotide ASO)应用引物扩增珠蛋白基因，同时合成与正常序列和突变
序列完全互补的寡核苷酸探针。
将PCR扩增产物点在尼龙膜上，分别
与标记的正常和突变的ASO探针杂交，不完全互补的探针，在一定条
件下可以完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。
如果两个等位B
珠蛋白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅
与突变探针杂交。
这种检测方法快速、灵敏。
缺点：对DNA的纯度和
数量要求较高，一次杂交能检测一种突变，对于具有高度异质性的B
地中海贫血往往需要多次更换探针杂交，才能确定诊断，如使用同
位素标记探针，还存在放射性污染等问题。
5．3 反向点杂交方法(Reverse dot blot hybridization，RDB) 与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本原理相同，所不
同的是：将膜上固定探针取代固定靶DNA，经一次杂交就可对未知样
品中多个突变进行检测，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变
的方式。
优点：较快速、敏感，操作简单。
缺点：只能检测已知位
点突变的B地中海贫血，不能检出未知突变。
5．4 缺口PCR(gap PCR) 原理：设计三个或两对引物，即在
缺失区域外侧，靠近缺失位点的位置设计一对引物，另外一个或一
对引物在缺失区域内。
在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人
中扩增出片段，在缺失纯合子中不能扩增。
在缺失区域外侧的一对
引物，因为缺失使相距甚远的两端DNA拉进，从而可扩增出特定的
DNA片断。
从而检测出纯合子患者，杂合子携带者。
Wang等报道用此方法对89个B珠蛋白基因突变的检测。
5．5 扩增不应突变系统(amplification refractorymutation sys—tems，ARMS)或称等位基因特异性PCR 原理：在PCR中，针对某个点突变设计出3端碱基与目的基因的突变碱基互补的引物，PCR反应中，只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因则不能扩增。
从而将正常与突变的DNA区别开来。
优点：仅需微量的DNA样品(100～400 ng)，通过简单的设计，仅需同一种PCR循环体系便可同时探测常见B珠蛋白基因突变，无需PCR之后的分子杂交等过程，不需限制性内切酶及放射性核素。
缺点：特异性较低，易出现假阳性或假阴性。
有报道应用该方法进行B地中海贫血的检测。
5．6 实时荧光定量PCR(real—time PCR) 在实验过程的PCR 体系中加入荧光集团，由于被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关，具体可以通过特定的定量PCR仪监测每次循环产生的荧光信号强度，并参照对照基因的标准曲线来定量，荧光染料能与所有的DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制。
缺点：由于选取的相对定量和标准曲线本身存在局限性，所得结果存在误差。
国内外有报道采用该方法进行B地中海贫血的检测?。
5．7 单链构向多态性PCR(PCR—SSCP) 与PCR联合应用，即PCR．SSCP是一种基于单链DNA构象差别来检测未知点突变的常用方法。
原理：PCR产物在加热或变性剂下生成单链，单个核苷酸的改变即可造成DNA片断单链的改变。
根据构象不同的单链DNA在非变性
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)条件下电泳表现不同的迁移率，电泳带用银染法显示，无放射性核素污染。
可用于检测B地中海贫血基因缺失的病人及携带者，是一种筛查未知点突变的有效方法。
缺点：当PCR 产物小于200 bp．可检出70％～90％的突变率，敏感度随PCR的长度
5．8 等位基因特异性扩增技术(Allele Specific PCR，AS—PCR) 原理：针对B地中海贫血的突变类型设计特异碱基引物，根据扩增得到的电泳带判断是否存在对应的点突变，结果清晰、准确可靠，尤适用于小片段DNA分析，可作为快速检测携带者的筛查手段。
5．9 DNA芯片技术(DNA chip) 以反向斑点杂交为基本原理。
将预先设计好的大量核酸探针有序、高密度地显微打印在玻璃片、硅片等固体支持物上，制成DNA微阵列。
用荧光标记的待测样品DNA、eDNA或RNA与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，用特制的软件对荧光信号进行分析处理，便可得到待测样品的遗传信息或表达信息。
优点：高通量，基因诊断可在一张芯片上完成，适用于大面积的筛查。
缺点：设备要求及费用较高，目前难以推广。
5．10 DNA序列测定法(DNA sequencing) 常用于分析基因的未知或已知突变。
应用PCR扩增产物在DNA自动测序仪上进行序列分析。
该法快速、简便、灵敏，重复性好，是基因突变检测的最直接、最准确的方法。
5．11 荧光聚合酶链反应(Fluorescent PCR) 荧光PCR是近年发展起来的新兴技术，它比普通的PCR敏感性高出一千倍以上。
用不同颜色的荧光素对PCR扩增产物进行标记，在DNA测序仪上同时检测出不同颜色、不同片段的PCR扩增产物，从而分辨正常人，杂合子和纯合子。
国外已有报道利用荧光PCR检测B珠蛋白基因簇大片段缺失。
而国内应用荧光PCR进行地中海贫血植入前遗传学诊断，胎儿羊水和脐带血地中海产前基因诊断，及检测单单细胞B地中海贫血基因。