二、原理
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它 生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体 金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状 及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而 使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细 胞生物学等领域。
二、原理
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶 体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗 粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而 形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各 种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球 形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球 菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、 激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而 在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
第十四章 免疫检测新技术
第2节影响
章节安排
第一节 生物素-亲和素免疫检测新技术
的因素 第二节 免疫胶体金检测新技术
第三节 免疫电镜技术 第四节 免疫转印技术
[目的与要求]
1、了解标生物素-亲和素免疫检测技术的原理及 种类。 2、理解免疫胶体金检测技术的原理及常用的检 测方法。
3、了解免疫电镜技术的应用。
在所检病毒样中加入已知抗血清，使形成抗原
(病毒)—抗体复合物，经过超速离心或琼脂、滤
纸浓缩、过滤系统后将此抗原—抗体复合物浓集
于电镜铜网的For-mar膜上，负染色后进行电镜
观察。由于抗体将病毒浓缩在一起，比直接观察
散在病毒粒子的方法大大提高了敏感性。
二、病毒检测
目前有几种方法：①经典的免疫电镜法是将待检样 品与抗血清混合反应后，超速离心，吸取沉淀物染色 观察；②快速法是在琼脂糖凝胶上打孔，下垫滤纸， 孔中加入待检样品与抗血清混合液，然后将铜网膜漂 浮于孔中的免疫反应液滴上，待液滴被滤纸吸下后取 出铜网膜、染色观察；③抗体捕捉法是先将用抗血清 包被铜网膜，然后将此包被有抗体的铜网膜悬浮于待 测病毒溶液的液滴上，作用一定时间后，染色铜网膜 并观察。
二、基本步骤
目的蛋白质的分离
转印
免疫检测
思考题：
目前肉类中瘦肉精的检测最简单、快捷的 方法是什么？如何进行检测结果的判断？
4、了解免疫转印技术的原理及应用。
[难点与重点]
重点：免疫胶体金检测技术的原理。 难点：免疫胶体金检测技术的原理。
第一节 生物素-亲和素免疫检测新技术
利用生物素与亲和素专一性结合以及生物素、
亲和素既可标记抗原或抗体，又可被标记物所
标记的特性，可建立生物素-亲和素系统来显示
抗原抗体特异性反应的各种免疫检测技术。
三、常用的免疫胶体金检测技术
3、斑点免疫金渗滤法
应用微孔滤膜(如NC膜)作载体，先将抗原或抗
体点于NC膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶
体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。
三、常用的免疫胶体金检测技术
4、胶体金免疫层析法
将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶 体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当 待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作 用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互 反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物 与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法 现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
三、常用的免疫胶体金检测技术
1、免疫胶体金光镜染色法
细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的
抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银
显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记
的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。
三、常用的免疫胶体金检测技术
2、免疫胶体金电镜染色法
可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样 本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病 毒形态的观察和病毒检测。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
1、亲和素-生物素—过氧化物酶技术(ABC法) （2）应用： ①组织切片和细胞悬液中抗原的检测 ②在免疫电镜中的应用 标记抗体渗透性是免疫 电镜技术的关键，小分子的生物素就可得到更高的 渗透力，且生物素化抗体可在组织包埋前或包埋后 加入，因此ABC法进行抗原的亚细胞水平定位分析 得到较好的应用。
二、原理
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主 要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白 结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物 在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色 斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中， 这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免 疫金银染色。
四、免疫胶体金检测技术的应用
免疫胶体金检测技术主要应用于组织化学染色、
基础免疫学研究(如通过胶体金标记的CD分子单克 隆抗体采用流式细胞术检测淋巴细胞亚群)和疾病 诊断。
第3节 免疫电镜技术
免疫电镜技术(immune electron microscopy，IEM) 是将抗原抗体反应的特异性与电镜的高分辨能力相 结合的检测技术，该方法始建于1941年。IEM主要 包括两个方面应用：①在电镜下利用标记抗体，直 接对抗原在分子水平上进行定位；②利用特异性抗
使用步骤：1．加入一抗，与切片孵育。如加入兔抗 肿瘤相关抗原的抗体。2．加入生物素化二抗，如生物 素化抗-兔IgG。3．加入亲和素-生物素化酶复合物 （ABC）。4．加入酶作用底物，定位抗原。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
2、桥亲和素-生物素技术(BRAB)
原理及应用：方法是用生物素分别标记抗体和酶， 然后以亲和素为桥，把两者连接起来。检查抗原时， 先用生物素标记的抗体与细胞(或组织内)的抗原反应， 洗去未结合的抗体，加人亲和素孵育后，洗去未结合 的亲和素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以 细胞化学方法呈色反应。
第三节
免疫转印技术
免疫转印(immunoblotting)技术又称蛋白质印迹
或Western blotting，是一种将蛋白质凝胶电泳、膜
转移电泳与抗原抗体反应相结合的新型免疫分析
技术。
一 、原
理
蛋白质(病毒、细菌蛋白)经SDS—聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)，根据相对分子质量大小分成区带， 然后通过转移电泳将SDS- pACE上的蛋白质转印到 硝酸纤维素滤膜上，在转印膜上加上相应的标记抗 体(如酶标抗体、胶体金标记抗体、荧光抗体、放射 性同位素标记抗体)，也可先加抗体反应，再加标记 的抗抗体，通过对结合抗体的标记物的检测，以分 析特异性抗原蛋白区带。
一、生物素与亲和素的特性
2、亲和素 (avidin)：是一种存在于鸡蛋清中的碱性糖 蛋白，结晶呈白色粉末状，易溶于水。在pH 2～13 缓冲液中性质稳定，消化道多种蛋白水解酶不能使其 失活。它对热的耐受性较强，经80℃温度作用2min 仍保持活性。亲和素是由4个相同的亚单位组成的四 聚体，富含色氨酸，通过色氨酸与生物素的咪唑环呈 十分牢固的结合。亲和素的每个亚单位可结合1个分 子生物素，因此1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
二、原理
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小 的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态， 形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定 的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负 电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合， 由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物 特性。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
3、标记生物素-亲和素技术(LAB)
L体。
BRAB法和LAB法都需以生物素标记第1抗体，应
用不如ABC法普遍。但是，用于免疫细胞中免疫球
蛋白的显示具有特异性。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
4、生物素-亲和素或链霉亲和素ELISA检测技术
目前最灵敏的免疫组化二抗检测系统 由于亲和素和生物素有极强的亲和力（其亲和力
比抗体和大多数抗原的亲和力高100万倍），因而亲
和素和生物之间的结合是不可逆的。此外，亲和素
具有4个生物素结合位点，大多数蛋白质包括酶可以
和多个生物素分子结合。利用这些特征，可以把亲
和素和生物素化的酶结合为大分子复合物（ABC’s）。
体捕获、浓缩相应的病毒，经负染后在电镜下检查
病毒粒子，可用于病毒病的诊断。
一、抗原定位
用酶、铁蛋白、胶体金标记的特异性抗体，对组织切
片进行染色，结合电镜技术，可对细胞或组织内抗原的
分布进行定位。根据标记物的不同，免疫电镜技术可分
为电镜免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白标记技术、免
疫胶体金技术等。
二、病毒检测
一、生物素与亲和素的特性
1、生物素 生物素(biotin)是一种广泛分布于动、植物 组织的生长因子，亦称辅酶R或维生素H，尤以蛋黄、 肝、肾组织中含量较高。结构式中的咪唑酮环是与亲 和素结合的主要部位。利用生物素的羧基加以化学修 饰后，可以制成各种活性基团的衍生物，称为活化生 物素。针对不同的被标记物可以应用不同类型的活化 生物素。
包括BAB-ELISA，BA-ELISA和ABC-ELISA等技 术。
第2节 免疫胶体金检测技术
一、概
述
免疫胶体金标记技术是以胶体金颗粒为示踪标记物 或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记 技术。已广泛应用于光镜、电镜、流式细胞仪、免疫 转印、体外诊断试剂的制造等领域。 胶体金即水溶胶，是一种带负电荷的疏水胶体溶液， 具有一般溶胶的特性，主要通过还原剂将氯化金分子 聚合成特定大小金颗粒的方法而产生。可通过采用柠 檬酸、抗坏血酸钠和白磷等还原氯金酸或四氯化金而 制备胶体金。胶体金颗粒可通过静电吸引及其表面的 物理特性与多种生物分子(如抗体、SPA)相结合，形 成蛋白质-金颗粒复合物，即胶体金标记物(胶体金探 针) 。