冰冻切片的制备
一、冰冻切片技术的概述
（一）优点：
1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。
2．快速，用时短。
3．组织变化不大。
4．能很好保存脂肪，类脂等成分。
5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
（二）缺点：
1．不容易做连续切片。
2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。
3．不容易制作较薄的切片。
4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
（三）主要应用于：
1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。
3．用于临床手术的快速病理诊断。
二、冰冻切片机的使用及注意事项
（1）新鲜的组织制备
组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
（2）固定组织的制备
为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
（3）恒冷箱温度
一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。
每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下：组织刀温度组织温度恒冷箱温度
肝-18 -10 -5
肾-15 -8 -5
皮肤-35 -10 -5
脑-18 -5 -5
固定组织一般高3-5度
（4）抗卷板
抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。
抗卷板略高于刀面的最高点。
可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20゜
（5）切片机
操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。
即可切片。
恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。
（6）切片刀新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。
如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。
三、冰冻干燥
原理
为冰冻组织保持高度真空，直到去除组织中的水分。
过程
小块组织骤冷→立即在真空干燥脱水（－30～－40℃）冰升华，水气去除，不会发生酶的弥散→材料干后，升到室温浸于石蜡或碳蜡包埋。
特点
能出色地保存组织的酶活性，还有助于保持组织的结构。
但仪器贵，需时长。
四、冰冻替代法
原理
低温下用液体脱水剂取代组织中的水分。
过程
组织块骤冷→组织内的水，在低温（－40℃～－70℃）液体脱水剂中被替代（醇、丙酮），同时起到固定作用→脱水组织渐恢复到室温，用石蜡包埋。
特点
①新鲜组织在24小时内制成切片
②可保存较多的酶活性
③经济、简单且有重复性，但对细胞器保存不佳，不能用于电镜
电镜标本的制备
一、概述
20世纪30年代（1935年）在德国发明并生产了第一批电子显微镜以来，应用日渐广泛，使组织学的研究上了一个新的台阶，开避了新纪元，从一般显微结构领域迈入了亚显微结构水平。
（一）透射电镜（transmission electron microscope，TEM）：是最广泛使用的一类电镜。
它的特点是电子束必须穿透样品，因此观察的样品必须很薄，约为50nm左右。
可观察细胞和组织的超薄切片，复型膜，负染样品等。
（二）扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）：主要特点是观察物体表面的立体微细结构。
其在医学上主要用于观察组织或细胞的表面或断面结构，扫描图像具有立体感，样品制备较简单，因此在医学上应用日渐增多。
二、标本的制备
（一）取材
1．原则：
快、准、轻、小、冷；1mm3
2．注意事项：
（1）防止组织挤压和过度伸展；
（2）使用锋利的刀，尽量减少对组织的机械性损伤；
（3）取材最好在冰块上，或同时放在固定液内操作；
（4）培养细胞的收集时，要将培养液离心后，取沉淀物漂洗固定。
（二）固定
1．常用固定操作的方法
（1）戊二醛-锇酸双重固定法
前固定：2%戊二醛
后固定：1%锇酸
（2）培养细胞固定法
培养细胞需要固定时，先弃去培养液，加入戊二醛固定液，在冰溶或4℃的温度下放置5~10分钟，再用刮板将细胞刮下，倒入离心管中离心弃上清，沿管壁缓缓加入预冷的戊二醛固定液15 ~30分钟，再吸去上清，经缓冲液清洗15分钟后，继用1%锇酸对样品作后固定30分钟。
2．注意事项
（1）理想的固定剂应能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞杀死尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形。
（2）固定液的酸碱度必须与被固定组织的酸碱度基本一致，大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4。
（3）缓冲液的选择要根据实验不同要求加以选择；磷酸盐缓冲液可以有效地控制固定液的酸碱度，并能促进样与铅盐、铀盐之间的反应，是动物组织的有效缓冲系统，但缺点是可抑制细胞内某些酶（如6磷酸葡萄糖脱氢酶）的反应。
（4）戊二醛固定后必须充分浸洗，才能转入锇酸固定。
（5）戊二醛固定液一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸钠缓冲液配制，不能用醋酸—巴比妥缓冲液，因此缓冲液可使戊二醛的醛基失效。
（三）脱水
1．脱水过程
脱水剂：乙醇或丙酮
彻底清洗样品
50%乙醇或丙酮10~15分钟
70%乙醇或丙酮10~15分钟
80%乙醇或丙酮10~15分钟
90%乙醇或丙酮10~15分钟
100%乙醇或丙酮10~15分钟
100%乙醇或丙酮30分钟
2．注意事项：
（1）脱水要彻底；
（2）如果当天完不成浸透、包埋操作时，应将样品停留在4℃70%乙醇或丙酮中过夜。
（3）脱水操作动作尽量要快，特别是100%脱水剂，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥。
（四）浸透和包埋
1．浸透包埋剂：Epon812环氧树脂包埋剂
A液：Epon812 10ml
DDSA十二烷基琥珀酸酐16ml
B液：Epon812 10ml
MNA六甲酸酐8.9ml
A液和B液按比例混合，B液比例越大，包埋块越硬（冬天1：4；夏天1：9），待上述二液混匀后再按1.5~2%的体积比，在充分搅拌中滴加DNP-30
2．过程
（1）脱水后的样品入丙酮、环氧丙烷等量混合液15min
（2）环氧丙烷Ⅰ15min
（3）环氧丙烷Ⅱ15min
（4）环氧丙烷、包埋剂等量混合液数小时
（5）纯包埋剂数小时
3．包埋
（1）定向包埋
（2）烘干包埋板
（3）37ºC ~45ºC恒温箱中24小时
（4）60ºC恒温箱24小时
（5）72ºC恒温箱24小时
4．注意事项
（1）浸透、包埋用注射器、吸管、烧杯、胶囊、牙签及其它器皿，均应在用前烘干，有能有任何水分。
（2）所用的药品均应注意防潮，药品应在干燥器中存放或在冰箱里保存。
（3）包埋时动作要轻巧，避免产生气泡影响切片。
（4）操作时皮肤勿接触包埋剂，以防引起皮炎。
（5）制好的包埋块应放于带盖的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋块吸潮变软影响切片。
（五）半薄切片
包埋块的修整
切片刀的制备：玻璃刀，钻石刀
定位
（六）超薄切片
选择与清洗载网
制备支持膜
切片
捞片
（七）电子染色
1．电子染色剂
（1）醋酸铀：浓度为饱和液
醋酸铀2g
50~70%乙醇100ml
PH4.2
（2）铅盐类
硝酸铅Pb(NO3)2 1.33g
柠檬酸钠Na(C6H5O7)·2H2O 1.76g
蒸馏水30ml
将上试剂放入50ml容量瓶内，用力振荡30分钟，发生化学反应，结合为柠檬酸铅，溶液呈现为乳白色的柠檬酸铅混悬液，然后加入1N氢氧化钠8ml，使柠檬酸铅溶解，变成无色透明状，
最后再加蒸馏水至50ml，PH为12 2．过程：
（1）醋酸铀滴注染色30分钟（2）清洗3次
（3）柠檬酸铅滴注染色30分钟（4）自然干燥即可电镜观察。