Part 1: 蛋白表达、纯化
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蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
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E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
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Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
终止子
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a: 如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够 阻止转录通读过位于下游另一个启动子
b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱 动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。
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保护碱基 内切酶1 目的基因 内切酶2 保护碱基
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X gene
complex
yes yes yes yes yes high
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一：大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)
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Vector
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可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10% - 30%以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的, 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 常用的大肠杆菌表达载体启动子：
λ噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。
b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。
c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
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Characteristics
doubling time cost of growth medium expression level protein folding
N-linked glycos.
O-linked glycos. phosphorylation acetylation acylation g-carboxylation project cost
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。 追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导 入寄主细胞 同任何一种目的启动子连接Байду номын сангаас, 其表达活性可作为 检测启动子功能的依据。
β－半乳糖苷酶基因lacZ 荧光素酶基因 (luciferase )基因、 半乳糖激酶基因(galK ) 氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat ) 四环素抗性基因 (tetr ) Tag-
二 大肠杆菌表达载体的基本组成
一个良好的大肠杆菌表达载体： 复制起点(ori) 多克隆位点。 筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记） 控制和调节转录与翻译的必不可少的原件
外源基因在原核寄主细胞中表达, 它的编码结构 必须是连续的, 不间断的, 处于寄主启动子有效 控制下。
启动子
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Insect
slow (18-24 hrs) high
low – high proper folding
simple, no sialic acid yes yes yes yes no
middle
Mammalian
slow (24 hrs) high
low – moderate proper folding
引物的设计：设计一对特异性 引物。上游、下游引物引入酶 切位点
oligo6
RNA提取：TRNzol（附件）
RT-PCR：附件
1：DNA marker；2：X 基因扩增产物 图1.1 X基因的RT-PCR扩增产物