纤维素酶
纤维素是细胞壁的骨架物质。纤维
素水解酶活动可使果实成熟细胞壁 纤维素网有很明显的溶解活动。纤 维素水解导致的超微结构改变，并 不完全是由于细胞壁纤维素分子的 溶解，而且与非纤维素组分的降解 引起微纤丝组分损失有关。
1、淀粉酶 (amylase)
二、碳 水化合 物代谢 相关酶
2、蔗糖磷酸 合成酶(SPS)
载体为媒介的 基因转移 植物转基因技术 (gene transplant technology)
DNA直接转移
载体(vector)为媒介的基因转移
ⅰ 根癌农杆 (Agrobacterium tumehciem)
ⅱ Ti质粒(Tumor inducing plasmid)
ⅲ Ri质粒 (Root inducing plasmid)
发育成完整植株的过程。
细胞融合技术(cell amalgamation
technique)：又称细胞杂交，指
在一定的条件下将两个或多个
细胞融合为一 个细胞的过程。
细胞重组(cell recombination)：
就是在体外条件下，运用一定的技
术从活细胞中分离出各种细胞的结
构或组成部件，再把它们在不同细 胞之间重新装配，使其成为具有生
鉴定
ⅰ Southern Blot 杂交技术
ⅱ Northern Blot杂交技术
ⅲ Western Blot杂交技术
为了从分子水平鉴定在植物转基因的过程中，外源基因是 否已经整合到植物的染色体中，是否转录，表达，经常用 到琼脂糖凝胶电泳(agargelelectrophoresis)与分子杂交 的分析手段。这种手段包含以上三种技术。
第四章 园艺产品采后 生物技术
【教学目标】 1. 了解生物技术的内容及其组成部分 2. 了解基因工程的关键技术 3. 掌握反义基因技术的基本概念、原理和特点 4. 了解细胞工程的基本过程 5. 认识园艺产品成熟衰老相关酶的特点及其作 用 6. 了解采后生物技术在园艺产品中的应用，并 熟悉几个案例 7. 了解采后生物技术的发展趋势、展望及存在 的问题
§2
园艺产品采后生物技术
一、基因工程
二、细胞工程
一、基因工程
1、基因工程的基本过程
2、反义基因技术
1、基因工程的基本过程
① 目的基因的分离
② 外源基因的转化
③ ④ 筛选 鉴定
目的基因的分离
ⅰ PCR扩增法ⅱ构建cDNA (cDNA library)ⅲ 合成法
目的基因(objective gene)
Northern Blot与杂交技术
这是一种与Southern
Blot 类似的杂交 技术，主要特点是电泳图谱为RNA图谱， 而不是DNA图谱。转基因植物的Northern Blot 显示阳性，说明转化的外源基因已 经顺利转录形成 mRNA 。
Western Blot杂交技术

提取转基因植物的蛋白质，电泳之后分 离蛋白，之后转移到硝酸纤维素膜上， 然后利用抗体与抗原的结合反应，检测 外源基因在转基因植物中的表达情况， 即是否产生外源基因所编码的蛋白质。
利用生物有机体(从微生物到高等
动植物)或其组成部分(包括器官、 组织、细胞或细胞器等)发展新产 品或新工艺的一种技术体系。
1.基因工程 (genetic engineering)
2.细胞工程 (cell engineering)
生物技术的内容
3.酶工程 (enzyme engineering) 4.发酵工程 (fermentation engineering)
基因枪转基因技术
基因枪(gene
gun)又叫粒子轰击，是 一种将载有外源DNA(目的基因)的钨 (tungsten)或金等金属颗粒(直径0.55μm)加速到每秒数百米的速度，穿过 细胞壁射入细胞质(cytoplasm)中的物 理学方法。采用的加速动力是火药或 高压放电，或高压气体(氮气、氢气、 氧气)加在粒子上的瞬时动量。
又叫靶基因(target
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
gene)，是 指根据基因工程的目的和设计所 需要的某些DNA分子的片段，它 含有一种或几种遗传信息的全套 密码(code)。
分离、合成目的基因的方法
1) PCR扩增法：当已知目的基因的序列时，通 常利用PCR(Polymerase Chain Reaction 即 多聚酶链式反应)技术来分离目的基因。 PCR技术是1985年由美国Cetus公司开发的 专利技术，它能快速、简便地体外扩增特定 的DNA片段，具有高度的专一性和灵敏度
果胶酯酶 (pectinesterase,简称PE)

PE的功能是脱去半乳糖醛酸(galacturonic acid)竣基上的甲醇基，从而有利于PG分解 多聚半乳糖醛酸链。PE在决定PG降解果胶 的程度上起重要作用，PE的活动似乎是PG 发生作用的前提。由于PE的诱导，引起细 胞壁果胶物质的甲酯化作用，并降解成可 溶性果胶。但PE与果实的后熟软化可能没 有重要的联系。
根癌农杆菌介导的基因转移技术

根癌农杆菌是使受感染植物形成冠瘿瘤 (crown gall)的病原因子。冠瘿瘤的形成 是由于根癌农杆菌含有一种大的Ti质粒 (plasmid)，它使一组控制植物激素(生长 素、细胞分裂素)基因从根癌农杆菌转移 并整合到植物细胞基因组的结果。 根癌农杆菌介导的基因转移技术是目 前应用最广泛、最成功的转基因技术。
ⅰ ⅱ ⅲ ⅳ ⅴ DNA直接转移 ⅵ ⅶ ⅷ ⅸ ⅹ
基因枪 (gene gun) 原生质体直接转移法 激光微束穿孔法 电泳转移法 超声波穿透法 花粉管通道法 花粉吸收(外源DNA)转化(授粉)法 微注射(显微操作注射)法 种子或胚的DNA浸泡法 脂质体融合法
③ 转基因方法
ⅰ 根癌农杆菌介导的基因转移技术 ⅱ 基因枪转基因技术特点 ⅲ 原生质体直接转基因技术

筛选
植物外植体(explant)经过农杆菌或DNA直接转 化后，大部分的细胞是没有转化的，只有极少 数被转化，这就需要采用特定的方法将未转化 细胞与转化细胞区分开来。 目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化 细胞的淘汰常用抗生素抗性基因和除草剂基因 (总称筛选标记)。如： cat基因、ACC(3)、 dhfr 、Spt、bar 、 NptII(neomycinphosphotransferase)等。
成蔗糖和己糖，伴随有SPS活性增加， 这种淀粉降解和糖含量的增加与SPS 最大活性值有关，认为SPS是上述过 程蔗糖合成所需要的。
植物脂氧合酶 (LOX)
ⅰ 高度专一地调节某一特定基因的表达
ⅱ 转化到植物中的反义RNA的作用类似于 遗传上的缺陷型,表现为显型性状
特点
ⅲ 反义基因整合到植物的基因组中可独 立表达和稳定遗传,后代符合孟德尔遗 传规律(Mendelian Genetics Rule) ⅳ 利用反义基因可省去对基因产物的研 究工作 ⅴ 反义基因不改变靶基因的结构
② 反义RNA
技术的特点
2、 反义 基因 技术
① 反义基因 技术的基本概 念和原理
反义基因技术:指将目的基因反向构
建在一个启动子(promotor)上,再转化 给受体植物,通过培育形成转基因植物,
这种植物可能产生与该基因的mRNA互
补结合的RNA链,成为反义RNA,其结果 使植物中相应的mRNA的合成受阻。
木葡聚糖内糖基转移酶 (XET)

XET是最近发现的一种能引起细胞壁膨胀松 软，并与果实软化相关的酶。木葡聚糖是 一种细胞壁的结构多糖，对细胞壁的膨胀 性起限制作用。 XET具有内切和连接的双 重效应，在切开木葡聚糖链后，可将断链 转移到另一个受体链上去，即把切口新形 成的还原末端与另一个木葡聚糖(受体)分 子的非还原末端相连接起来 。
分离、合成主要应用于分离植物组织中丰富表达的基 因。对于表达量较少的基因，可通过限制性 内切酶切割、电泳分离富集之后使用。然后， 通过提取植物中的mRNA，经过逆转录酶的作 用合成CDNA(complimentary 基排列顺 序，就可以采用不同的核苷酸为原料，用特 定的酶催化，直接合成目的基因。
淀粉酶 (amylase)

淀粉作为细胞内含物对细胞起着支撑作用， 并维持着细胞膨压。果实采后后熟和贮藏 过程，淀粉被水解并转化为可溶性糖，从 而引起细胞膨胀力的下降，导致了果实的 软化。淀粉的降解是由淀粉酶催化完成的， 因为淀粉酶活性的快速上升而引起淀粉迅 速水解。
蔗糖磷酸合成酶(SPS)
狲猴桃等果实成熟过程淀粉水解生
物活性的细胞过程。
§3 采后园艺产品成 熟衰老的相关酶
一、细胞壁降解相关酶 二、碳水化合物代谢相关酶 三、植物脂氧合酶 (LOX)
一、细胞壁降解相关酶
1、多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase，简称PG) 2、果胶酯酶 (pectinesterase,简称PE) 3、木葡聚糖内糖基转移酶 (XET) 4、半乳糖苷酶 5、纤维素酶
第四章 园艺产品采后生物技术
§1 生物技术的基本概念
§2 园艺产品采后生物技术 §3 采后园艺产品成熟衰老相关酶
§4 园艺产品采后生理代谢基因及 其表达
§1 生物技术的基本概念
一、生物技术的概念 二、生物技术的内容
生物技术(biotechnology)，也称
生物工程(bioengineering)，指

外源基因的转化
ⅰ 植物转基 因技术(gene transplant technology)
ⅱ 分类
ⅲ 转基因方法
植物转基因技术(gene transplant technology)

定义：就是利用生物、物理或化学等手段， 将外源基因导入植物细胞，以获得转基因 植株的技术。 目前的植物转基因技术可分为两大类， 即以载体(vector)为媒介的基因转移 vector mediated gene transfer和DNA直 接转移 naked DNA transfer。