纳米抗体库富集步骤：
1）抗原包被、宿主菌接种：取30μg抗原，溶解到1ml包被缓冲液（pH=9.6）中，加入到Maxisorp免疫试管（Thermo Nunc）中，4℃静置12h；
从平板上挑取一个TG1单菌落至10ml 2×TY培养基中，37℃摇床摇过夜，次日重新1：100接种用于筛库；
2）封闭：免疫试管PBST、PBS分别清洗5次，3% BSA 3ml加入到免疫试管中，于混合器上缓慢滚动封闭2h；
3）准备宿主菌：过夜菌以1:100的比例提前2.5h（相对于第六步侵染）重新接种于新鲜的2×TY中，于37℃摇床扩增培养，保证在第6步侵染时OD600达到0.4~0.6（大肠杆菌OD600=1.0，大肠杆菌浓度为109/ml左右）；
4）加抗体库：免疫试管PBST、PBS分别清洗10次（每次洗液需静置几秒钟），加入500μl原抗体库+500μl3% BSA，微量振荡器上室温剧烈滚动1h，然后室温静置1h；
4）酸洗脱：免疫试管PBST、PBS分别清洗10次（每次洗液需静置几秒钟），尽量倒干管内液体，以免残留液影响到下一步洗脱液的pH值，而影响洗脱效果；
洗脱液10mM的HCl（pH=2.0）800ul（应少于抗原包被量）加入到免疫试管中，室温剧烈震荡30min后，将洗脱液转移到到无菌的50ml离心管中，用260μl Tris-HCl（pH=8.0）中和至pH值7.0左右），大约可以洗脱106~8个纳米抗体噬菌体；
5）侵染TG1：向上所得洗脱液中加入5ml新鲜的TG1（OD600=0.4~0.6），混匀后，37℃静置40分钟，然后将侵染液稀释1000倍（取侵染液1μl加入到1ml的2×TY液体培养基中），然后分别取10μl、50μl稀释液分别涂布于Amp平板上（同时进行阳性和阴性对照），平板倒置于37℃孵箱内孵育过夜，根据平板上的细菌数目计算从免疫试管上洗脱下来的噬菌体的数目；
6）M13K07侵染：剩下的侵染液加入5ml新鲜的2×TY于37℃摇30分钟，然后加入5μl 的M13K07（约1011个噬菌体），37℃放置1h，4500rpm室温离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的2×TY培养基中，加Amp至100ug/ml，Kan至50ug/ml，葡萄糖加至1%，30℃，200rpm摇16-20h；
7）纯化富集抗体库：将过夜菌转移到无菌50ml离心管内，4800rpm，4℃离心20分钟，上清液转移到新管中，按照1/5的体积比例加入40%PEG 4000＆2.5 M NaCl 液，强烈震动后冰浴30分钟。

4800rpm，4℃离心20分钟，弃上清，沉淀重悬于1ml无菌PBS缓冲液中，然后再于12000rpm，室温离心5分钟，取上清，即为筛选第一轮的抗体库；
8）滴度测定：OD268进行滴度测定，当OD268=1.0时，噬菌体的浓度为5×1012个/ml；
9）第2、3、4、5轮次，可以按照以上步骤重复。

Nunc孔筛选与免疫试管筛选操作上的不同：
（1）包被：先于37℃包被1h，然后于4℃包被过夜（250ul/孔）；
（2）封闭：分两步封闭，先是乙醇胺活性位点封闭，然后再BSA等非活性位点封闭；
（3）清洗：在BSA封闭之前都只能用PBS清洗孔，BSA封闭完后再用PBST，
因为PBST中的活性剂TWEEN可能会影响Nunc孔的化学结构.
注：因为考虑到TG1是没有任何抗性的，所以在每一次筛选涂板计数的同时平行做阳性对照及阴性对照：
阳性对照：即从VHH原库（约有1011个噬菌体）中取1ul，在2×TY中稀释1000倍，取1ul稀释液（约有108个噬菌体）侵染TG1后取适量涂Amp平板，以检验TG1宿主菌是否具有侵染能力及状态是否良好，以便判断问题的所在；
阴性对照：直接取适量TG1菌液涂于Amp平板和Kan平板，以便于观察是否被污染.。