绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆
南方医科大学学院
摘要
本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达
实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆
2015- ~
实验日期
实验地点
2015-
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方
法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原
理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤
二、实验原理
1.pEGFP-N1质粒
2.T载体
三、材料与方法：
1.实验材料：
质粒：pEGFP-N1
T载体：pUCm-T
菌种：DH5(克隆菌)
PCR引物：
F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA
R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC
Tm=56
实验试剂：
即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）
快速DNA连接试剂盒
限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）
Axygen质粒提取试剂盒
抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)
X-gal、IPTG等
实验仪器：
超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等
2.方法
分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子
四、实验具体流程
1.获取外源基因
1)碱裂解法提取质粒
使用Axygen质粒提取试剂盒
离心1300r pm,1min
瞬时离心
漩涡震荡颠倒数次
悬浮沉淀
颠倒数次离心
放置
3-5min 13000rpm,1min
离心
13000rpm,1min
2)
取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：
H
2
O 6μl
质粒DNA（pEGFP-N1）2μl
引物GFP1 (10μM) 1μl
引物GFP2 (10μM) 1μl
Premix Taq 10μl
总体积20μl
加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
PCE参数设置：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环
② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环
72℃ 1 分钟
③ 72℃ 7 分钟
④ 4 ℃保温
3)琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒
凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上样（1μlPCR产物，6μl loading buffer混合点样）→点marker→电泳→取出凝胶→拍照
2.构建重组DNA
使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。
按下表加入试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验
实验组①对照组②
即用型蓝白T载体 1 μl 1 μl
PCR扩增产物 1 μl —
Control Insert DNA — 1 μl
快速连接缓冲液(2X) 5 μl 5 μl
超纯水-ddH2O 2.5 μl 2.5 μl
Rapid T4 DNA ligase 0.5 μl 0.5 μl
总体积10 μl 10 μl
添加完成后，冰箱内16℃反应45分钟
3.重组DNA的转化
1)预先制备好感受态细胞。
2)转化DNA，为了检验转化是否成功，设置对照组实验
实验组：10μl PCR产物/蓝白T载体连接产物+ 100μl感受态细胞
阳性对照组：10μl Control Insert DNA/蓝白T载体连接产物+100μl感受态细胞
阴性对照组：10μl无菌双蒸水 + 100μl感受态细胞
步骤：（分别制作3组）将10μlDNA和100μl的感受态细胞加入试管中→冰浴30min →42℃水浴精确90s→迅速转移至冰浴冷却1-2min→加入800μlLB培养基→恒温
培养箱中37℃培养45min
3)检测重组DNA：涂布平板筛选
步骤：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素（Amp、X-gal、IPTG）的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。
室温放置几分钟，倒置平皿37℃培养过
夜。
4.重组DNA的筛选
培养的菌落在筛选培养基中，白色的菌落含有重组体pUC18，蓝色菌落则没有或只有载体pUC18。
挑选白色单菌落扩大培养：
用接种棒在白色单菌落上挑取菌落，接种于4mlLB/Amp+培养液中，37℃震荡培养过夜。
5.重组DNA的鉴定
从扩大培养的菌液中提取重组质粒DNA，再进行限制性内切酶酶切，经行琼脂糖凝胶水平电泳。
进行对照实验。
250μ
l 250μl
溶液S1 裂解液S2
取5μl加
1lloading
buffer混合
五、结果与讨论：
最后插入质粒中的DNA片段应为740bp，重组质粒大小应为3038bp+740bp=3778bp 实验结果现象与讨论
碱裂法提取质粒pEGFP-N1质粒大小为4.7kb，电泳
显示光带与marker5k相近，说明质
粒提取较成功。
电泳显示出两条带，可能原因：
1、加入S2时颠倒力度过大造成
DNA断裂。
2、加入S2变形时间过长。
3、加入S3复性时间过长。
4、提取的质粒不够纯净。
PCR扩增目的基因只出现两条带，
其中有接近
750bp的光带，
说明目的基因
在PCR扩增中
得到扩增。
重组DNA的筛选实验组培养基中：
1是蓝色菌落
2是白色菌落
阳性对照组培养基中只有白色菌落
阴性对照组培养基中无菌落
说明重组DNA较为成功。
1 2 5000
2000
750
2000
1 2
扩增中，虽然有接近750bp的光带，但亮度微弱，说明在实验过程中，
坏严重，所以到后面实验中，重组成功的细菌，量不多，光带亮度都微弱。
而在实验过程中，我们在需要颠倒的步骤发现我们颠倒完后的管中出现气泡，这是其他小组没有的。
所以经过总结，认为我们加入溶液时颠倒力度过大，导致质粒断裂，所以显示的光带亮度都比其他小组的暗。
最后鉴定中酶切DNA没有出现740bp的光带，可能原因也与上面所说的有关，在操作时我们也出现了气泡，认为是颠倒力度过大导致目的基因断裂。