非放射性标记法
直接法
荧光素（fluorescein）或其他荧光染料
间接法
地高辛（digoxigenin） 生物素（biotin）
1. 随机引物法 2. 缺口平移法 3. PCR法 4. 寡核苷酸末端标记法 5. 直接在探针3’或5’端合成
1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul
原位杂交操作步骤
一、准备载玻片和固定材料 二、染色体标本制备和预处理 三、探针制备及标记 四、染色体标本变性 五、杂交 六、杂交后洗脱 七、免疫细胞化学检测 八、荧光显微镜观察及显微摄影
染色体标本制备
预处理
1、RNA酶处理
1） 每张玻片加100 μl 100 μg/ml RNase A (in 2x SSC) 37℃处理1小时
NaCl, 0.05% Tween 20] 37℃洗1x5min
免疫细胞化学检测
1பைடு நூலகம் TNT buffer冲洗 2. TNB buffer[100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl,0.5% blocking reagent] 3. Anti-DIG-荧光素(2 μg/ml, in TNB)37℃30min 4. TNT buffer冲洗3x5min 5. 乙醇系列脱水,气干 6. DAPI染色10min 7. 加Vectashield封片,荧光显微镜下观察并照相
5种荧光素联合标记人类24条染色体
荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
FITC ☆
☆☆ ☆
☆☆ ☆
☆☆☆ ☆
Cy3
△ △ △ △ △△
△
△
△△
Cy3.5
○
○○
○○ ○○
○○ ○ ○
Cy5
※※※※
※※
※※※※
对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细 胞或组织上的位置显示出来的一项技术。
该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建 立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列 DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分 重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对 的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技 术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。
4. 混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时
5. 65 ℃处理10min终止反应
染色体标本变性
共变性
杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中10分钟
分别变性
70%甲酰胺，2xSSC 70 ℃处理2分钟 70%，85%，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥
杂交
1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚 糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针，每 10ul杂交液含50ng探针
影响杂交的因素
一、影响杂交的主要因素
温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺
二、其他因素
探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗脱严谨度
三、标准杂交条件
FISH技术的应用
基因定位 染色体结构变异(异位、缺失、重复)研究 染色体物理作图 疾病及产前诊断 外源基因检测 多倍体起源进化研究 分子核型研究 染色体（质）空间结构研究
2. 探针95 ℃变性5分钟，置冰水中10分钟 3. 10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片 4. 湿盒中37℃杂交过夜
杂交后洗脱
1. 2x SSC, 50%甲酰胺45 ℃洗3x5min 2. 2x SSC 37℃洗2x5min 3. TNT buffer [100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
2）用2x SSC洗3×5min 3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟
2、胃蛋白酶处理
1） 0.005-0.02% pepsin（10 mM HCl） 37℃处理10 min 2） 1×PBS洗2×5min 3） 1×PBS，50 mM MgCl2处理5min 4） 1×PBS，50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5） PBS洗涤并脱水,气干
Cy7
◆
◆
◆
◆◆◆◆ ◆ ◆ ◆
Chromosome Lab
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
第一节 原位杂交技术简介 第二节 荧光原位杂交技术的应用 第三节 原位杂交操作步骤 第四节 影响杂交的因素 第五节 荧光原位杂交技术的新进展
原位杂交技术简介 in situ hybridization
原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则， 将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNA互补配
2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中
3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/μl Klenow enzyme; 5x
random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP)
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH