三、电泳方法
4. 等电聚焦电泳法
可用于蛋白质分子的分离。 蛋白质分子的等电点 pI，pH < pI 时，带正电；pH > pI 时，带负电。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
4. 等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳法：电解槽中放入载体两性电解质，接
通电源，形成一个从阳极 阴极 pH 逐渐增大的 pH 梯
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
4. 等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳建立的前提：稳定 pH 梯度的建立 建立的 pH 梯度非常稳定（无对流），由扩散和电迁 移所引起的物质运动处于动态平衡，两性电解质分子的
任何移动都会使其由不带电荷变以带电荷，在电场作用
下，再次迁移回到其等电点。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、电泳分离的基本原理
当平衡时，电场力与摩擦力大小相等而方向相反，即
qE fv
则
v
qE q q E 或 v E f 6 r 4 r
荷电粒子的电泳速度与电场强度成正比，与其有效电
荷、表观液态动力学半径、介质黏度成反比。
第二节 电泳分离的基本原理和分类
一、电泳分离的基本原理
电泳分离的基础：物质粒子在电场中迁移速度的不同
三、电泳方法
4. 等电聚焦电泳法
稳定 pH 梯度对载体两性电解质的要求： • 缓冲容量足够大，以维持 pH 梯度稳定 • 等电点处导电性好，以通过一定电流 • 分子要小，且不与被分离物质发生反应或使之变性 • 化学组成不同于被分离物质，不干扰测定
第四节 毛细管电泳
一、概述
毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）
第二节 电泳分离的基本原理和分类
二、电泳分离法的分类
2. 按有无固体支持物 支持物电泳
支持物：滤纸、薄膜、粉末、凝胶、海绵等 支持物形状：U 型管、柱状、平板、垂直、毛细管等 免疫电泳 免疫扩散 等电聚焦 pH 梯度 凝胶电泳 分子筛 高压电泳 高电压
第二节 电泳分离的基本原理和分类
垂直柱状凝胶电泳仪 垂直板状凝胶电泳仪
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、电泳分离仪器装置


水平板状凝胶电泳仪
上 样品凝胶
垂直柱状凝胶电泳仪 柱状凝胶管 中 浓缩凝胶（间隔凝胶） 垂直板状凝胶电泳仪 下 分离凝胶
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法

均相电泳法
不连续体系凝胶电泳法 SDS 电泳法 等电聚焦电泳法
不同物质在同一电场中，由于有效电荷、形状、大小
的差异，其电泳迁移的速度不同，可实现分离。
qE q q v E 或 v E f 6 r 4 r
第二节 电泳分离的基本原理和分类
二、电泳分离法的分类
1. 按分离的原理：
区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等 2. 按有无固体支持物： 溶液 自由电泳（显微镜、移界、柱、自由流动幕、 等速电泳等） 固体支持物 支持物电泳
制备：单体 丙烯酰胺，交联剂 甲撑双丙烯酰胺，
催化剂 过硫酸铵
聚合物链长 单体，交联程度 交联剂 电泳分离效果 凝胶理化性质 单体和交联剂
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、概述
分离原理：电泳分离电荷效应 + 凝胶分子筛效应
质点电荷 聚丙烯酰胺分类： 小孔凝胶：催化剂过硫酸铵，加速剂四甲基-1,2-乙 二胺（TEMED），缓冲液 pH = 8.9 大孔凝胶：催化剂核黄素，可不加 TEMED 网孔孔径
发展过程 • 1809 年，发现电泳现象； • 1907 年，研究白喉毒素在琼脂中的泳现象； • 1907 年，瑞典 Tiselius 制造了移动界面电泳仪，并分离
了马血清蛋白的 3 种球蛋白，电泳技术得以创建；
• 1948 年，德国 Wieland & Konig 采用滤纸为支持物进行
了电泳（纸电泳），创建了区带电泳；
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、概述
固体支持物：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖
凝胶、纤维素。
固体支持物性质：均匀性、化学惰性、易于重复制备
聚丙烯酰胺凝胶：孔径可调、非离子型聚合物（可有
效避免内渗和吸附对电泳分离的影响）
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、概述
聚丙烯酰胺凝胶：网状共聚物，结构见图 7-1。
以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以
样品的多种特性为根据的液相微分离分析技术。
3. SDS 电泳法
SDS (sodium dodecyl sulfate) 十二烷基磺酸钠，一种
阴离子表面活性剂。
SDS 能够破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之
间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法 3. SDS 电泳法 蛋白质溶液 + SDS 和强还原剂巯基乙醇后，蛋白质分子内 的二硫键被巯基乙醇还原，使蛋白质分子与 SDS 充分结合， 从而形成带负电荷的蛋白质SDS 配合物。 若在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的 SDS，则蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量大小，
Cl 离子迁移率大，移动快，在其后形成一个低离子浓度区
域（低电导区、电位梯度高），促使蛋白质样品离子和尾随 甘氨酸离子在其后加速移动，从而形成一个稳定向下移动的 界面（高电位梯度低电位梯度）。由于蛋白质样品离子的有 效迁移率介于前导和尾随离子之间，于是在两个电位梯度上
浓缩成一个薄层，如由原 1 cm 厚浓缩为 0.25 m 薄层。
第七章 电泳分离法

概述 电泳分离的基本原理和分类


聚丙烯酰胺凝胶电泳
毛细管电泳
第一节 概述
电泳分离法
借助直流电场的作用，将混合物中的带电质点根据其
移动速度的不同将它们分离分析的方法。
分离对象：
• 生化物质：在适当 pH 条件下，带有一定的电荷。如蛋 白质、核苷酸、核酸等 • 无机离子
第一节 概述
• 20 世纪 40~50 年代，出现醋酸纤维素膜、琼脂、淀粉 凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；
第一节 概述
发展过程
20 世纪 80 年代，Jorgenson & Lukacs 发展了高效毛细
管电泳，成为分离科学研究热潮和研究前沿之一。
电泳原理 电泳仪器（凝胶电泳、毛细管电泳）
生化分离分析三大方法：电泳、离心、色谱法 电泳是一种鉴别、分离、提纯的重要手段。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
4. 等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳建立的前提：稳定 pH 梯度的建立 pH 梯度由一系列具有不同等电点的小分子载体两性电 解质连续排列而形成，其在电场中按等电点的顺序排列，
在阳极和阴极之间形成一个平滑的 pH 梯度。在梯度中
每一点的 pH 取诀于该处载体的两性电解质的 pI 值。



第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
1. 均相电泳法（连续电泳法）
均相：电泳槽和电泳凝胶中放置的缓冲液相同，电泳
过程中 pH 处处相等，无浓缩效应。
样品：高浓度、小体积。 防止样品扩散：加入糖、尿素、丙三醇等，增加样品 密度
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
1. 均相电泳法（连续电泳法）
电泳分离系统中存在的三种离子：
• 前导离子：迁移率较大，只存在于凝胶中，如 Cl、K+ • 尾随离子：与前导离子电荷相同，迁移率较小，存在于缓冲液中 • 缓冲平衡离子：所带电荷与前二者相反，凝胶和缓冲液中均存在
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
2. 不连续体系凝胶电泳法
电泳分离系统中存在的三种离子： 电泳过程中，样品凝胶和浓缩凝胶中的 pH 需使有效 迁移率满足以下条件： 前导离子 > 样品离子 > 尾随离子
度介质。蛋白质分子在电泳作用下，迁移到周围介质 pH = pI 点时，蛋白质分子变为不带点，停止迁移，即“聚 焦”于该 pH 介质中。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
4. 等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳法： pI 点是蛋白质分子的特征属性，不同蛋白质分子的 pI 不同，聚焦于不同的 pH 介质中，从而实现彼此分离。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
2. 不连续体系凝胶电泳法
三种物理效应：样品浓缩效应、聚丙烯酰胺凝胶的分
子筛效应、电泳分离的电荷效应，大大改善分离效果。
应用：对大分子生化产品分离效率高，样器需求少
（微克级），适于蛋白质、脂、糖、核酸、肽类物质的
分离分析。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
二、电泳分离法的分类
2. 按有无固体支持物
分离科学中比较重要、常见的电泳技术： 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、概述
早期电泳技术，溶液中进行 自由溶液界面电泳。缺
点：存在对流和扩散，分离效果差。
固体支持物上进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰
胺凝胶电泳。优点：有效降低对流和扩散，改善分离效 果，区带分离更清楚，应用广泛。
第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、电泳方法
2. 不连续体系凝胶电泳法
如电泳分离血清蛋白： 电极缓冲液 Tris-甘氨酸缓冲液，样品凝胶和浓缩凝 胶中缓冲液 Tris-HCl，则离子迁移率 Cl > 蛋白质样品离子 > 甘氨酸离子
三、电泳方法 2. 不连续体系凝胶电泳法
如电泳分离血清蛋白：
Cl > 蛋白质样品离子 > 甘氨酸离子
第二节 电泳分离的基本原理和分类
一、电泳分离的基本原理
带电粒子在电场中以速度 v 移动时，所受电场力为：