析系统定量 。
取发酵液于12 000 r/min,4°C下离 心10 min,得到的菌体用Tris-HCl缓 冲液(50 mmol/L, pH 7.0,4°C)洗涤, 然后溶于上样缓冲液中[12mmol/L、 pH 6.8 Tris-HCl,甘油 (φ=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇 (φ=0.02),溴酚兰(0.5 g/L]。
结果与讨论
分批发酵
在5 L罐中分批培养
葡萄糖流加对于hIFNa2b 生产水平的影响
诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平 的影响
Interferona2b,hIFNa2b)
hIFNa2b是由165个氨基酸组成的多 肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、 修复DNA结构损伤等作用。
hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、
呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等 均具有治疗作用。
培养基： 种子培养基为LB培养基 蛋白胨10 g/L 酵母抽提物5 g/L NaCl 10 g/L 灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠 分批发酵培养基为含葡萄糖 5 g/L的LB 培养基
发酵罐培养
将二级种子以6%的接种量接入5 L 发酵罐(RIBE-5型)中。培养液装量 为2.5 L，生长阶段控制温度30°C, 表达阶段控制温度42°C，发酵过 程中控制pH为7.0,通气量4 L/min， 初始搅拌转速为400 r/min,发酵过 程中转速逐渐提高以维持溶氧大于 20%。
补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽 后采用3种不同的葡萄糖流加方式，即 恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率 流加。 恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入 葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(L· h)的速率 流加葡萄糖；恒比供应速率(QG)为 0.27 g/(g· h)，每小时根据菌体浓度调 整葡萄糖的流加速率。
基因工程菌 生产人干扰素
基因工程菌： 将目的基因导入细菌体内使其表达， 产生所需要的蛋白的细菌称为基因工 程菌，如：大肠杆菌。
菌株 ：宿主菌E. coli BL21(DE3) 重组质粒为pBAI 带有氨苄青霉素耐药性标记 hIFNa2b基因表达受λPL启动子 和质粒cI857编码的蛋白调控
目标产物：人干扰素a2b (Human
未特别注明的补料分批发酵培养基 葡萄糖 5 g/L的2×LB培养基 蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L 补料液为400 g/L的葡萄糖 培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均 为Oxoid产品,其余试剂为国产分析纯, 采用去离子水配制。
培养方法
种子培养
从-20°C保藏的甘油管中取出1ml菌 液,接入装有30 ml种子培养基的 250mL锥形瓶,于摇床200 r/min,30°C下培养10 h,为一级种子; 将一级种子以1.5%的接种量转接至装 有70 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中, 相同条件培养9 h,为二级种子。
3 0.5 ×பைடு நூலகம்0
测定方法
菌体浓度测定采用浊度法 测定波长600 nm处的光密度(OD600), 根据标准曲线计算菌体干重。 葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒测定 乙酸测定采用气相色谱法
hIFNa2b的电泳测定采用三(羟甲 基)甲基甘氨酸(φ=0.15)-SDS-聚丙 烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白 , 凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分