细菌耐药表型的检测（一）1. 葡萄球菌1.1 对β-内酰胺类药物1.1.1 耐药机制葡萄球菌对β-内酰胺类药物的耐药至少有三种不同的机制。

①产生添加的青霉素结合蛋白PBP2a；②大量产生灭活药物的β-内酰胺酶；③内源性的PBP被修饰（modified intrinsic PBPs，MOD-SA）降低了与药物的亲和力。

PBP2a由mecA基因编码，这个基因可能源自枯草杆菌，它所编码的PBP2a不但不与β-内酰胺类药物结合，而且能替代几种PBPs的功能，在细胞壁的合成中发挥转肽酶作用。

带有mecA基因的菌株可以是同质性的，在体外药敏试验中均表现耐药；也可以是异质性的，在体外试验中仅1/104-108个菌表现耐药。

大量产生β-内酰胺酶引起的耐药，是由于酶打开药物中的β-内酰胺环，使药物失去了与靶位（PBP）结合的能力，也称做药物被灭活。

MOD-SA型耐药是由于葡萄球菌原有的PBP1、2、4被修饰后降低了β-内酰胺类药物的亲和力。

表13-1 耐β-内酰胺类药物的葡萄球菌的苯唑西林表型分类苯唑西林mecA基因机制borderlinea耐药抑制剂作用β-内酰胺类交叉耐药其它药物交叉耐药R(同质性) + PBP2a - - + +R(异质性) + PBP2a ±- + +S - 产生β-内酰胺酶增加+ + - -R/S - PBP1、2、4被修饰+ - - -a：borderline耐药表型：稀释法中，苯唑西林MIC在2-8ug/ml之间，无明确终点；扩散法抑菌圈直径10-13mm，边缘不整齐。

b：表示可以有例外情况1.1.2 实验室检测β-内酰胺酶检测采用酸法、碘法和头孢噻吩（nitrocefin）法3种方法任一种均可。

苯唑西林耐药性检测NCCLS推荐用琼脂筛选法。

我们的具体方法是配制含40g/L NaCl 的MH琼脂（加水量为应加量的9/10），高压灭菌后分装试管每管9ml，加盖无菌橡皮胶塞后4℃保存。

配制60μg/ml苯唑西林贮存液过滤除菌后分装，每管1ml，-20℃保存（冰箱结冰室-18℃左右亦可）半年内有效。

临床用前将MH琼脂隔水煮沸溶化，冷至50℃以下，先将苯唑西林贮存液加入70mm直径的平皿，再倒入MH琼脂轻晃摇匀。

将待测的金黄色葡萄球菌，调至0.5麦氏单位，点种琼脂后30℃～35℃（不可超过35℃）孵育24小时，有任何生长现象即为耐药。

本法目前只适用金黄色葡萄球菌。

纸片扩散法检测苯唑西林的耐药性，方法同常规方法基本相同。

不同处为：MH琼脂中NaCl浓度为40g/L，金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径判断标准≥13mm为敏感，11～13mm为中介，≤10mm为耐药；凝固酶阴性的葡萄球菌：≥18mm为敏感，≤17mm为耐药，注意要将平皿对着光线检查抑菌圈内是否有菌落生长。

稀释法也是在MH中加入40g/L NaCl，金黄色葡萄球菌：MIC≤2μg/ml为敏感，≥4μg/ml为耐药；凝固酶阴性的葡萄球菌，MIC ≤0.25μg/ml为敏感，≥0.5μg/ml为耐药。

1.1.3 试验药物的选择和预报性在常规工作中，葡萄球菌对β-内酰胺类药物的药敏试验，可以只检测青霉素、苯唑西林和氨苄西林/舒巴坦来判断，如果能用硝噻吩法检测快速β-内酰胺酶最好。

青霉素敏感的菌株表示对所有不耐酶的青霉素类药物如氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等均敏感，β-内酰胺酶阳性或青霉素耐药、氨苄西林/舒巴坦和苯唑西林敏感，表示对耐酶青霉素类药物或青霉素类/酶抑制剂的复合制剂敏感。

苯唑西林耐药的葡萄球菌即目前被称为MRS（耐甲氧西林的葡萄球菌）菌株，这种耐药类型的细菌表示对所有的β-内酰胺类药物包括青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺类/酶抑制剂复合制剂、卡巴配能类均耐药。

而这些药物在体外试验中可显示有活性，如果被误报给临床，可能会误导临床用药。

同时苯唑西林耐药的葡萄球菌常常对红霉素、氯林可霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、旧喹诺酮或氨基糖苷类耐药。

此外，苯唑西林敏感，而上述抗菌药物出现较多交叉耐药的菌株，也要考虑MOD-SA型的耐药，提示临床慎用表型为β-内酰胺类敏感的药物。

1.2 对氨基糖苷类药物1.2.1耐药机制细菌可以产生多种酶灭活氨基糖苷类药物，这种灭活作用非常复杂，它们主要分为三大类：乙酰转移酶（AAC）、核苷转移酶（ANC）和磷酸转移酶（APH）。

每一类酶中又有许多亚类可以修饰不同位置上的羟基或氨基，导致不同的耐药表型，在葡萄球菌中（也发现在肠球菌中）最重要的是aac(6’)-Ie基因，编码产生双功能酶AAC（6’）加APH（2”）。

其APH（2”）部分可以修饰庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素，AAC（6’）部分可以修饰妥布霉素、奈替米星、卡那霉素和阿米卡星。

因此这种双功能酶实际使细菌对除链霉素以外的所有氨基糖苷类药物耐药。

有些酶能催化修饰不同的氨基糖苷类药物，但是由于酶对不同底物（药物）的米氏常数（Km）不同，其催化效率的高低使试验结果显现不同的表型。

如APH （3’）-III可以修饰卡那霉素、奈替米星和阿米卡星，但在常规药敏试验中却表现为对阿米卡星敏感，显现错误的表型，除了产生灭活酶外，在金黄色葡萄球菌中也发现由于核糖体被修饰后导致的对链霉素的耐药。

（同肠球菌详见本章2.2.1节）。

1.2.2 实验室检测及预报性对氨基糖苷类的耐药性最好检测其耐药酶。

临床可用的氨基糖苷类药物虽然并不多，但酶的种类、亚类却非常之多，因而只能在少量参考实验室进行此项工作。

目前我们只能根据常规药敏试验中的某些表现推测其可能存在的耐药机制，修改实验室结果，预测临床疗效。

下表列举了最常见的几种情况。

表13-2 葡萄球菌对氨基糖苷类药物的耐药预测表型推论机制预测耐药KmR TmS GmS AkS APH(3’) KmR TmS GmS AKI/RKmR TmR GmS AkS ANT(4’) KmR TmR GmS AkI/RGmR APH(2”)AAC(6’) 所有氨基糖苷类R（除链霉素外）Km:卡那霉素Tm:妥布霉素Gm:庆大霉素AK:阿米卡星R：耐药I：中介S：敏感1.3 对糖肽类药物已经有人报道分离到对万古霉素中等水平耐药的葡萄球菌，这种耐药的机制还不清楚，这些分离株的耐药性并非从肠球菌中获得对万古霉素的耐药基因所导致。

但是已经在实验室条件下，应用接合的方式将粪肠球菌对糖肽类药物的高水平耐药转移给金黄色葡萄球菌，采用纸片扩散法检测葡萄球菌对万古霉素的耐药，抑菌环直径≥15mm为敏感，≤14mm的菌株应该测MIC，当检验到万古霉素耐药的葡萄球菌时，应重新鉴定细菌和重复药敏试验，并送参考实验室确认。

1.4 对喹诺酮类药物喹诺酮类药物作用于细菌的DNA回旋酶（II型拓扑异构酶）和IV型拓扑异构酶，阻断了细菌的生长和分裂，起到杀菌作用。

当编码DNA回旋酶的gyrA基因和编码IV型拓扑异构酶的parC基因发生突变时，细菌产生耐药。

细菌细胞膜通透性改变也可引发耐药，这种耐药通常伴有对结构不相关药物的耐药，葡萄球菌对喹诺酮的耐药往往是parC基因的突变，这种耐药表型为对环丙沙星的耐药。

在葡萄球菌的药敏试验中，如果环丙沙星耐药，可预测氧氟沙星，左旋氧氟沙星耐药。

细菌耐药表型的检测（二）2 肠球菌2.1 对β-内酰胺类药物的耐药2.1.1 耐药机制肠球菌对β-内酰胺类药物的耐药可以是青霉素结合蛋白的改变，也可以是产生了β-内酰胺酶。

肠球菌自身的青霉素结合蛋白（PBPs）与β-内酰胺类药物的亲和力较低，青霉素对肠球菌的MIC通常≥2μg/ml，而对链球菌的MIC通常≤0.12μg/ml。

肠球菌的这种天性，表现为对β-内酰胺类药物的“相对耐药”，而肠球菌对青霉素和氨苄西林的耐药（MIC≥16μg/ml），是因为PBPs发生了改变，使亲和力进一步降低。

这种耐药性屎肠球菌（MIC 16～32μg/ml）比粪肠球菌（MIC 2～4μg/ml）更为突出。

β-内酰胺酶形式的耐药在肠球菌中非常少见，目前仅在粪肠球菌中发现产β-内酰胺酶的菌株。

2.1.2 实验室检测采用常规纸片扩散法或稀释法（肉汤稀释法或琼脂稀释法）能检测PBPs改变引起的耐药，不能检测产生β-内酰胺酶引起的耐药。

稀释法中要注意菌液浓度为107CFU/ml，比通常稀释法中的菌液浓度高100倍。

β-内酰胺酶的检测推荐使用头孢硝噻吩法（见1.1.2节）。

2.1.3 试验药物的选择及其预报性仅β-内酰胺酶阳性的肠球菌，预示对青霉素、氨苄西林、哌拉西林耐药，而对泰能、β-内酰胺类加酶抑制剂的复合药物敏感。

目前仅见到粪肠球菌β-内酰胺酶阳性报导。

血和脑脊液中分离的肠球菌检测β-内酰胺酶，可以尽早指导临床用药。

β-内酰胺类药物中选择青霉素和氨苄西林进行药敏试验即可。

β-内酰胺酶阴性、青霉素敏感的菌株对氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林以及他们与酶抑制剂的复合制剂敏感。

β-内酰胺酶阴性、氨苄西林敏感的菌株预示对氨苄西林/克拉维酸以及阿莫西林/舒巴坦敏感。

所谓对青霉素和氨苄西林“敏感”的分类，意味着对严重的肠球菌感染需要大剂量药物治疗。

青霉素、氨苄西林耐药的菌株，一般认为是PBPs改变，泰能即使敏感也应考虑耐药。

由肠球菌引起全身性严重感染（如心内膜炎等），如果对高浓度氨基糖甙类敏感，而氨苄西林耐药，应该检测氨苄西林的MIC，如果氨苄西林的MIC 16～64ug/ml，仍可以考虑与氨基糖甙类联合用药（详见下一节）。

头孢菌素类药物不宜选择进行肠球菌的药敏试验，因为其可以表现为体外试验敏感，而临床无效。

2.2 对氨基糖甙类高水平耐药2.2.1 耐药机制一般不选用氨基糖甙类单一药物治疗肠球菌感染，因为氨基糖甙类药物不易被摄入肠球菌，表现为内源性、中等水平耐药，MIC通常在8～256μg/ml。

当与作用于细胞壁的药物如青霉素、氨苄西林、万古霉素等联合用药，通过损伤细菌细胞壁，使氨基糖甙类药物进入菌体，与细菌30S核糖体亚单位结合，干扰蛋白质合成，发挥杀菌作用。

一旦出现对氨基糖甙类高水平耐药（庆大霉素的MIC≥500μg/ml，链霉素≥1000μg/ml），说明产生获得性的耐药。

此时，对链霉素的耐药是编码细菌核糖体的基因发生了突变，由于靶位的改变药物不能结合到作用部位，引起耐药；对其它氨基糖甙类药物的耐药是获得了新的基因，编码产生修饰药物的酶，使药物灭活。

2.2.2 实验室检测庆大霉素纸片含药量120μg/片，链霉素纸片含药量300μg/片，在MH琼脂上进行KB法药敏试验，两种药物的判定界点一样，即直径≥10mm为敏感，7～9mm为中介，≤6mm为耐药。

如果所测抑菌圈直径为7-9mm，表示试验无法定论，应使用琼脂筛选法或肉汤筛选法确定耐药性。

方法是配制庆大霉素含量500μg/ml的BHI肉汤或琼脂，链霉素含量1000μg/ml的BHI肉汤或2000μg/ml的BHI琼脂，肉汤法的接种菌量如标准肉汤稀释法，琼脂法接种菌量为0.5麦氏单位10ul菌液。