第六章体外放射分析技术【学习目标】了解体外分析技术的发展和现状。
掌握放射免疫分析的基本原理、基本方法及质量控制。
掌握免疫放射分析的基本原理及与放射免疫分析法的主要区别。
了解非放射免疫分析技术的几种类型，特别是时间分辨荧光免疫分析技术的基本原理及特点。
【内容要点】一、体外分析的发展和现状核医学体外分析技术主要是利用放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行机体内物质种类和含量的检测。
主要用来测定患者血清或体液中的激素、生物活性物质和药物浓度等。
它最早是在60年代由Yalow和Berson等偶然观察到125I标记的胰岛素与胰岛素抗体的结合与体系中存在的非标记胰岛素的量呈一定的相关性。
从而建立了放射免疫分析法。
放射免疫分析具有其它方法所不能比拟的特点：①灵敏度高；②操作简便，成本低。
免疫放射分析属于放射性非竞争结合分析，是在放射免疫分析理论的基础上，随着单克隆抗体技术的进步，不断发展而来。
非放射性标记的免疫分析从上世纪80年代以来得到快速发展。
如荧光酶免疫分析、化学发光酶免疫分析以及时间分辩荧光免疫分析等方法。
二、放射免疫分析（一）基本原理放射免疫分析的基本原理是利用放射性标记的抗原和非标记抗原同时与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应。
这种竞争结合反应可用下式表示：*Ag+Ab *Ag-Ab+*Ag+AgAg-Ab+Ag*Ag：标记抗原； Ag：非标记抗原； Ab：特异性抗体；Ag-Ab：抗原-抗体复合物；*Ag-Ab：标记抗原-抗体复合物*Ag -Ab的量（因变量）与Ag的量（自变量）之间存在的竞争性抑制数量关系是放射免疫分析的定量基础，这种数量关系可以由标准竞争抑制曲线（简称标准曲线）来表示。
（二）基本试剂放射免疫分析的反应中主要包括三种试剂；抗体、标记抗原、非标记标准抗原（标准品）。
除此之外，现在许多试剂盒还提供分离试剂或材料，缓冲液及质量控制用品等。
1、抗体放射免疫测定，需要选择亲和力大、特异性强、滴度高的使用。
2、标记抗原要求用于标记抗原的放射性核素比活度要高，放射化学纯度要好，还要有很好的免疫活性。
主要有125I、14C和3H。
3、标准品对标准品要求：①应与被测物属同一物质，其化学结构和免疫活性相同；②放射化学纯度高，影响分析的杂质少；③定量精确。
4、分离方法分离的目的是放射免疫反应达到平衡后，使抗原抗体复合物和游离抗原分离，两者分离后才能分别测量其放射性，理想的分离技术应具备既安全又迅速，不受其它因素干扰，操作简便，重复性好等优点。
分离方法主要有：双抗体法、沉淀法、双抗体法+沉淀法、吸附分离法、固相分离法等。
5、放射性测量仪器如用125I做标记，常用γ井型计数器对γ射线进行测量。
如用3H或14C做标记用液体闪烁计数器对β射线进行测量。
（三）质量控制（quality control,QC）放射免疫分析的质量控制包括：实验室内部质量控制和实验室间质量控制。
1、实验室内部质量控制主要指标：零标准管结合率、非特异性结合率、最低浓度管和最高浓度管的结合率之差应大于30%、标准曲线连线回归的参数、ED25、ED50、ED75和质控图。
2、试剂盒质量控制主要指标：精密度、灵敏度、准确度、特异性、稳定性、健全性。
3、实验室外质量控制三、免疫放射分析免疫放射分析是放射免疫分析的变种，是非竞争性的反应。
可用下式表示：Ag+*Ab Ag•*Ab+*AbAg:待测抗原*Ab：标记抗体原理是以125I标记抗体，用过量的标记抗体与待测抗原（或标准品）结合。
形成标记抗体-抗原复合物和剩余的标记抗体。
待反应平衡后，分离出多余的游离抗体，测上清液中的放射性，将待测抗原的结合率与标准抗原的标准曲线进行比较，即得所测样品的含量。
目前常用实验方法有抗体夹心法、标记第三抗体法、双标记抗体法。
免疫放射分析具有反应速度快、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。
但目前还主要限于蛋白质和多肽抗原，很多小分子半抗原和短肽还不能应用。
四、非放射免疫分析1、酶标记免疫分析典型的酶标记免疫分析是酶联免疫吸附法。
2、化学发光免疫分析技术主要有：化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析技术、电化学发光免疫测定。
3、时间分辩荧光免疫分析 TRFIA是一种特殊的荧光分析法，其原理是用具有长荧光寿命的物质作为荧光标记物（常用的是稀土元素，即镧系元素）标记抗原或抗体，通过测定荧光量，定性或定量分析抗原或抗体。
该方法具有特异性强、稳定性好、适用范围宽、样品用量少、自动化高、且速度快等优点。
但仪器主要靠进口，试剂品种少。
【习题】一、名词解释1．放射免疫分析法2．免疫放射分析法3．放射受体分析法4．受体放射分析法5．(RIA的)NSB6．RIA中的B07．抗体的亲和力8．抗体的特异性9．抗体的滴度10．RIA的特异性11．时间分辨荧光免疫分析法12．稳定性13．精密度14．灵敏度15．准确度16．健全性17．核医学体外分析技术18．质量控制19．放射免疫分析误差二、中英文互译1．放射免疫分析2．竞争性蛋白结合分析法3．放射性非竞争结合分析4．免疫放射分析5．酶免疫分析技术6．化学发光免疫分析技术7．时间分辨荧光免疫分析技术8．标准曲线（校准曲线）9．亲和力10．滴度11．标记抗原12．labeled antibody13．Standard14．Specificity15．Precision16．Accuracy17．Perfectly18．recovery rate19．quality control20．quality control sample21．increasing amounts22．Hapten三、单项选择题1．在放射免疫分析用试剂中，最常用于标记抗原放射性核素是A. 131IB. 125IC. 99m TcD. 3HE. 32P2．放射免疫分析法中，所用的标记抗原的放化纯度应大于A. 90%B. 80%C. 70%D. 60%E. 50%3．放射免疫分析法的基本原理是A.放射标记抗原与过量的特异抗体进行结合反应B.放射标记抗原与限量的特异抗体进行结合反应C.放射标记抗原与限量的特异抗体进行竞争结合反应D.放射标记抗原和非标记抗原与限量的特异抗体进行竞争结合反应E.放射标记抗原和非标记抗原与过量的特异抗体进行竞争结合反应4．一般用变异系数（CV值）作指标对放射免疫分析试剂盒进行质量评价，要求将批间CV值控制在以下范围A. 1%~5%B. 5%~10%C. 10%~15%D. 15%~20%E. 20%~25%5．用回收率来代表体外放射分析技术的准确度，一般对回收率的质控要求是将回收率控制在以下范围A. 90%~95%B. 90%~100%C. 90%~105%D. 90%~110%E. 90%~115%6．放射免疫分析A.是非竞争性体外放射分析技术的代表B.是竞争性体外放射分析技术的代表C.是体外放射分析技术的代表D.以上三者都是E.以上三者都不是7．放射免疫分析标准品A.与待测样品不一定具有相等免疫活性和亲和能力B.与待测样品有相等免疫活性和亲和能力C.与待测样品无相等免疫活性和亲和能力D.与待测样品有相等免疫活性和无相等亲和能力E.与待测样品无相等免疫活性和有相等亲和能力8．免疫放射分析A.是非竞争性体外放射分析技术的代表B.是竞争性体外放射分析技术的代表C.是体外放射分析技术的代表D.以上三者都是E.以上三者都不是9．RIA的特异性可用什么来表示。
A.抗原的免疫活性B.抗体的交叉反应率C.抗体的亲和力D.抗体的滴度E.抗体的分子量10．免疫放射分析法的基本原理是A. 放射标记抗原与过量的特异抗体进行结合反应B.放射标记抗原与限量的特异抗体进行结合反应C.抗原与限量的特异抗体进行结合反应D.抗原与过量的特异标记抗体进行结合反应E.放射标记抗原和非标记抗原与限量的特异抗体进行竞争结合反应四、多项选择题1．对放射免疫分析标准曲线的质量控制指标有以下要求A.最高结合率（B%）要求在30%~50%B.非特异结合率（NSB%）要求小于5%~10%C.标准曲线的相关系数（γ值）要求大于0.99D.标准曲线的以下参数要求保持稳定：截距a，斜率b，ED50E.以上都不是2．竞争放射分析技术包括多种方法，它们具有以下几个共同特点A. 都能对生物活性物质进行超微量（10-9克~10-15克）定量分析B. 特异性强，与同类待测物质交叉反应小C. 灵敏度高，标本用量少，0.1毫升血清标本足够用D. 检测范围比免疫放射分析法宽E. 以上都是3．免疫放射分析法是典型的非竞争性体外放射分析的代表，在反应体系中加入以下物质A. 过量的抗体B. 待测物（或标准品）C. 放射标记抗体D. 限量的抗体E. 放射标记抗原4．以抗原与抗体间的免疫反应为基础的分析技术有A. 放射免疫分析法（Radio immunoassay，RIA）B. 免疫放射分析法（Immunoradiometric assay，IRMA）C. 放射受体分析法（Radio releptor assay，RRA）D. 放射酶分析法（Radio enzyme assay，REA）E. 化学发光免疫分析法（Chemiluminescence immunoassay,CLIA）5．放射免疫分析用标准品A. 与待测样品属于同一物质B. 与待测样品有相等免疫活性和亲合能力C. 高纯度，不含有任何可以影响分析的物质D. 精确定量，一般选用经数次提纯的抗原中免疫活性最高的来定量E. 比活度和放化纯度足够高6．用125I和3H来进行标记，要求标记物A. 标记物用量应低于或等于被测物的最小量，定量范围一般在10-9~10-12克水平B. 标记物要有较高的比活度C. 标记物的放射化学纯度在95%以上D. 保证抗原抗体结合的免疫活性在标记过程中不被破坏E. 对标记物注意保存过程中发生的变化，如：辐射自分解等7．对特异性抗体的要求A. 要有较高的滴度B. 在较长时间使用同一批抗体，可减少批间误差C. 稀释倍数加大可提高精确度D. 稀释倍数减少，可减少批间误差E. 要有较高的亲和力和特异性8．免疫放射分析法是典型的非竞争性体外放射分析的代表，以标记抗体作为示踪剂在反应体系中加入A. 过量的抗体B. 用标记抗体作示踪剂C. 加宽检测范围D. 用标记抗原作示踪剂E. 限量的抗体9．以抗原与抗体间的免疫反应为基础的分析技术有A. 放射免疫分析法B. 免疫放射分析法C. 化学发光免疫分析法D. 时间分辨荧光免疫分析法E. 酶标记免疫分析技术10．常用的质量控制指标中，零标准管结合率（B0%）的影响因素为A. 一抗效价降低或失活B. 标记的放射性核素脱落C. 缓冲液浓度及pH值不适D. 温育时间不合适E. 温育温度不合适11．体外放射免疫分析技术基本类型有A. 以配体与受体间的结合反应为基础的分析技术B. 以酶与底物间的酶促反应为基础的分析技术C. 免疫放射分析法D. 竞争性蛋白结合分析E. 以上都不是12．体外放射免疫分析基本步骤有A. 加样B. 温育反应C. 结合物与游离物分离D. 放射性测量E.数据处理13．在放射免疫测量中对标记抗原的要求有A. 与原抗原生物活性一致B. 放射性核素的半衰期不能太短C. 比活度足够高D. 放化纯度足够高E. 高亲和力、高特异性、高滴度14．RIA分析中，抗体的质量指标有A. 亲和力B. 特异性C. 免疫活性D. 滴度E. 比活度15．恒量RIA准确度的方法有A. 回收率B. 健全性实验C. 交叉反应率D. 质量控制样品E. 抗体的亲和常数16．RIA分离方法中，使离心后沉淀中含抗原抗体复合物的分离方法主要有A. PEG沉淀法B. 吸附法C. 双抗体法D. 固相法E. 活性炭吸附法17．放射免疫分析体系中，基本试剂有：A. 抗体B. 标记抗原C. 标准品D. 标记抗体E. 以上都是18．免疫放射分析体系中，基本试剂有：A. 抗体B. 标记抗原C. 标准品D. 标记抗体E. 以上都是五、填空题1．放射免疫测量中对标记抗原的要求有——————————、—————————————、——————————————。