张云波等 (2000)
以黄海杆菌 YS9412 - 130的突变株 YS9412 - 130
- SW - 140原生质体作复合诱变处理获得的
碱性低温蛋白酶 , 20℃测定酶活 3 912 u /mL
杨文博等 (1994)
NTG处理原生质得到产酶 13 977 u /mL
·2·
胡学智 蛋白酶的生产和应用 (下 )
10 000 u /mL。
无损 。
表 1 我国碱性蛋白酶的研究情况
菌种
研究者
说明
地衣芽孢杆菌 2709 地衣芽孢杆菌 2709 短小芽孢杆菌 289 短小芽孢杆菌 209 短小芽孢杆菌 209 地衣芽孢杆菌 2709 - A5 地衣芽孢杆菌 2709 - C12 - 13 地衣芽孢杆菌 553F13 短小芽孢杆菌突变株 SM IP 地衣芽孢杆菌 53 - 38 - 6 (1997) 工程菌 BP071 工程菌 A16
收稿日期 : 2006 - 07 - 07 作者简介 :胡学智 (1929 - ) ,男 ,上海市人 ,教授级高级工程师 。研究方向 :生物技术与发酵工程 。
·1·
《江苏调味副食品 》2007年 第 24卷 第 4期 (总第 106期 )
与制革厂合作 , 从土样中筛选出微白色放线菌 4. 2 碱性蛋白酶
盐 , DEAE - Sepharose Fast Flow 离子交 换层 析 , Sephacryls - 200分子筛和 HPLC等方法提纯到电 泳纯 ,测得其分子量为 47 ×103 ,酶蛋白氨基酸组 成为中极性氨基酸占 17. 29% ,极性碱性氨基酸 占 4. 5% ,极性中性氨基酸占 58. 5% ,其它为非极 性氨基酸 , N 端氨基酸序列为 SKGSAVTTPQ ,序列 同源性比对表明该酶与其它曲霉酸性蛋白酶具有 极高的同源性 [ 9 ] 。上述酶学特性资料为该酶在 饲料上的应用及进一步研究提供了重要数据 。 4. 4 低温蛋白酶和耐高温蛋白酶
1 104 u /mL提高到 22 080 u /mL
无锡轻工业大学 ,唐雪明等 (2002)
产酶 24 480 u /mL
河北大学 ,潘延云等 (2002)
由地衣芽孢杆菌 2709与含碱性蛋白酶基因克隆
载体 PDW2 的工程菌枯草杆菌 BD105进行细
胞融合得到 ,产酶 30 000 u /mL
于丝绸脱胶的蛋白酶生产菌弗氏链霉菌 。 1993 世 。为了开展酸性蛋白酶的生产和应用的研究 ,
年上海市工业微生物研究所还对 1株酱油曲霉进 1960年 ,原上海市轻工业研究所对收集的 40 余
行诱变将酶活提高了 10 倍 。枯草杆菌 1938、栖 株曲霉 ,用麸皮固体培养作成麸曲后 ,分别用酪蛋
土曲霉 3942及放线菌 166 是国内生产中性蛋白 白和明胶为底物 ,在酸性和中性条件下测定蛋白
～12 000 u /mL , 3942由 3 000 u /mL提高到 4 000 经 pH 值为 3的酸液 60℃处理 30 m in后 ,再在 pH
～5 000 u /mL ,固体培养达 15 000 u / g以上 , 166 值为 7 下测定 ,酶活尽失 ,而在酸性条件下测定 ,
的产酶能力由 4 000 u /mL提高到现在的 8 000～ 则活性几乎无损失 ,而黑曲霉经酸处理后则酶活
酶的主要菌种 ,它们的发酵产酶水平在近 30多年 酶活性 ,结果发现 ,所有黄绿色曲霉无论在酸性或
的不断改进下 ,有了较大的提高 。1938的酶活由 中性条件下 ,均可测出蛋白酶的活性 ,而黑曲霉则
当初的 2 000～3 000 u /mL 提高到现在的 10 000 只在酸性条件下才有强烈的活性 。将黄绿色曲霉
166,其蛋白酶用于猪羊皮脱毛 ,具有脱毛较净 ,毛
碱性蛋白酶是国内研究得较为广泛和深入的
孔清晰 ,不损粒面等优点 。该酶首先在上海酒精 一种酶制剂 ,具体研究情况见表 1[ 1 - 6 ] 。
厂投产 ,湖北省微生物研究所等也筛选出中性蛋
1995年以来 ,随着生物技术的发展 ,在利用
白酶生产芽孢杆菌 172,经免疫等交叉凝聚反应 基因工程和蛋白质工程定向改造生产菌种的产酶
The production and applica tion of protea se
HU Xue - zhi
(B ioengineering Research Center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200000)
Abstract: In order to have a better understanding of p rotease, some general studies about different p roteases are intro2 duced. They are neutral p rotease, alkaline p rotease, acid p rotease, cryo - p rotease and p rotease with high - temperature to le rance. Key W ords: p rotease; study; general introduction
1969年 ,原上海市工业微生物研究所应新疆 建设兵团要求研制酸性蛋白酶以供毛皮软化之 用 。通过利用 120多株黑曲霉和柠檬酸生产突变 株 ,用 5种培养基进行摇瓶培养筛选 ,并用麸皮添 加铵盐为氮源进行固体培养 ,结果在固体培养下 , 有 30%的黑曲霉酸性蛋白酶活力可达 7 000～14 000 u / g,在液体深层培养时 ,黑曲霉 3350、3867、 宇佐曲霉 B1和玉桂色曲霉 No. 81等均是酸性蛋 白酶生产潜力较大的菌种 。在对黑曲霉 3350 培 养条件进行详细研究后 , 1971年在上海酒精厂投 产 ,发酵液中的酶可用盐析法提取 ,也可用单宁聚 乙二醇提取 ,结合乙醇沉淀法可得到酶活性达 700 000 u / g、收率达 65%以上的制品 ,产品试用 于毛皮 、制革 、啤酒澄清及羊毛染色和医药等方 面 ,均取得了良好的成效 。 1975 年 ,新疆沙漠土 壤研究所与科学院微生物研究所合作 ,对宇佐曲 霉 B1进行人工诱变 ,得突变株 537,由于产酶活 性较高 ,培养基也较简单 , 3350的液体培养被 537 所取代 。1992年 ,浙江省农科院微生物研究所钱 玉英等以黑曲霉 Van Tieghem Cpu 4为母株 ,采用 Co60γ线辐 照处 理 , 得 突变 株 6042, 酶 活 提 高 4 倍 ,固体培养下产酶达 18 000 u / g,干燥麸曲用为 猪饲料添加剂 ,饲养各生长阶段的猪 ,获得良好效 果 。固体培养酸性蛋白酶中除蛋白酶外还含有半 纤维素酶 、纤维素酶 、淀粉酶 、果胶酶和植酸酶等 与消化有关的酶 ,其含量因菌株及培养方式而异 , 因其成本低廉故可取代一部分进口饲料酶 。
我国目前在开发低温碱性蛋白酶资源方面 , 已取得了一定的进展 。张云波和王跃军等以黄海 杆菌 YS 9412 - 130 为出发菌种 , 经 NTG、EM S、 UV与微波处理 ,得到变异株 130 - SW 1 - 140,碱 性蛋白酶活性提高 16倍 , 20℃测定摇瓶试验酶活 为 2 320 u /mL。进一步将 SW 1 - 140 制备原生 质体后再作为复合诱变处理 ,对大量突变株进行 筛选和淡水驯化 ,最终获得高产株 SW 2 - 104,产 酶达到 3 910 u /mL ,按照设计的中试技术 ,每吨发 酵液可得活力 20 ×104 u / g的粗酶 20 Kg[ 10 - 12 ] 。 通过一系列纯化 ,已制备出纯度大于 99%的试剂 酶 ,经化学修饰法 ,结合酶的紫外吸收光谱变化研 究结果表明 , 9412 - 130 低温碱性蛋白酶的性质 与丝氨酸蛋白酶有着很大的相似性 [ 13 ] 。
黄海杆菌突变株 SW 2 - 104 短小芽孢杆菌 C172 - 415
上海合成洗涤剂厂 (1965)
从进口洗衣粉中分离得到
复旦大学新型发酵厂 (1971)
发酵罐 40 h产酶 5 000 - 6 000 u /mL
沈阳林土所 (1974)
土壤分离 , 10 m3 发酵罐 20 h产酶 6 000 u /mL
胡学智 蛋白酶的生产和应用 (下 ) 文章编号 : 1006 - 8481 ( 2007) 04 - 0001 - 04
蛋白酶的生产和应用 (下)
胡学智
(中国科学院上海生物工程研究中心 ,上海 200000)
摘 要 :为充分了解蛋白酶 ,介绍了我国在中性蛋白酶 、碱性蛋白酶 、酸性蛋白酶 、低温蛋白酶和耐高温蛋白酶 研究概况 。 关键词 :蛋白酶 ;研究 ;概况 中图分类号 : TS201. 2 + 5 文献标识码 : B
用 。何秉旺等用紫外线处理栖土曲霉 3374 得突 变株 3942,使蛋白酶活力提高 28%。李禄先等又 筛选出用于丝绸脱胶的芽孢杆菌蛋白酶生产株 S 114。1964年 ,中科院微生物所 、江苏省食品发酵 研究所合作 ,就北微所筛选的枯草杆菌 1938蛋白 酶的生产条件进行详细研究 。 1965 年完成中试 后于新建的无锡酶制剂厂投产 。 1965 年上海市 工业微生物研究所对栖土曲霉 3942 蛋白酶的液 体和固体培养工艺条件进行了研究 ,发现当采用 固体培养时 ,添加 3% ～5%纯碱 ,碱性 、中性蛋白 酶活性可增加 30% ,采用液体培养时添加洗净剂 LS 0. 1% ,可使通风量下降 50%以上 ,酶活性增加 60%。1967 年 与 温 州 味 精 厂 合 作 完 成 中 试 。 为筛选制革用新菌种 ,轻工业部食品发酵研究所
河南省皮革研究所
土壤分离 , 10 m3 发酵罐 25 h产酶 5 000 u /mL
天津酶制剂厂 (1975)
上海市工业微生物研究所 (1991)
原生质诱变 市工业微生物研究所 ,天津酶制剂 人工诱变 ,产酶 21 000 u /mL