食品微生物课件
本次课程内容
1.自然界中分离的方法步骤 2.微生物的诱变育种 3.微生物的杂交育种 4.原生质体融合P148）
1.采样 2.增殖培养 3.纯种分离 4.纯培养 5.生产性能测定
菌种分离的方法
从生产中选育：在生产过程中，微生物以一定频 率发生自发突变。为选育优良的生产菌种创造 了机会。
充分利用复合处理的协同效应（synergism）
诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同 效应，这对育种工作是很有参考价值的。 复合处理有几类： ①两种或多种诱变剂的先后使用； ②同一种诱变剂的重复使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用。
利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
❖ 为了确切某一突变株产量性状的提高程度，必须进行 大量的分析测定和统计工作，而一些形态变异虽能直 接和迅速地加以观察，但又不一定与产量变异相关。 如果能找到这两者间的相关性，则育种时初筛的效率 就可大大提高。如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种 中，发现菌落的棕红颜色变深者，产量往往有所提高
❖ 形态、生理与代谢产物产量间的相关性常常可通过人 们的努力而加以创造。利用鉴别性培养基的原理或其 它方法就可有效地把原来肉眼所观察不到的生理性状 或产量性状转化为可见的“形态”性状。例如，在琼 脂平板上，通过蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶变色圈 的大小，抗生素抑制圈的大小，生长因子周围某菌生 长圈的大小，以及外毒素的沉淀反应圈的大小等，都 可用于初筛工作中估计某菌产生相应代谢产物能力的 “形态”指标。
二、诱变育种
诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理 均匀而分散的微生物细胞群，促进其突 变率显著提高，然后采用简便、快速和 高效的筛选方法，从中挑选少数符合育 种目的的突变株，以供生产实践或科学 研究之用。
诱变育种具有极其重要的实践意义：当 前发酵工业和其他微生物生产部门所使 用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通 过诱变育种而明显提高其生产性能的。
获得均匀分散的细胞悬液的方法：用无菌的玻璃珠打碎 成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤。诱变后出现的不 纯菌落，则可用适当的分离纯化方法加以纯化。
诱变育种工作中应考虑的几个原则
选择简便有效的诱变剂：
物理诱变剂：紫外线、激光；X射线、γ射线和 快中子等。
化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶 类化合物。
化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反 应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较 有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上 涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很 小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片）， 经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别 制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多 单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变 种。
以及产孢子早而多的菌株 ③选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株； ④细菌中发现称为增变菌株的变异菌株，更适宜作出发菌
株； ⑤在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少
能累积少量所需产物或其前体的菌株，而在选择产抗生 素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次 的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
例：定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株
的方法
先在培养皿中加入10ml的一般琼脂培养基，使皿底 斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上 倒10ml含有适当浓度（通过实验来决定）的异烟肼培 养基，斜放、待凝。在制成的琼脂平板上存在一个由 浓到稀的异烟肼的浓度梯度。然后涂以大量的酵母细 胞，经培养后，在低浓度的异烟肼区域，长满了原始 的敏感菌，在高浓度区域，酵母细胞生长受到了抑制， 在浓度适中的部位出现少数由抗异烟肼的细胞所形成 的菌落。这类抗性菌落可能因产生了可分解异烟肼的 酶类，更多的是通过合成更高浓度的代谢产物——吡 哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制作用。在酵母菌中， 通过梯度平板法曾获得吡哆醇产量比原菌株提高7倍的 突变株。应用同样原理，还可获得其它种种有关代谢 产物的高产菌株。
定向培育优良品种：一般指用某一特定因素长期 处理某微生物的群体（culture population）， 同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累 并选择相应的自发突变株的目的。
采用梯度平板法（gradient plate）：筛选抗代谢 拮抗物的突变株，以提高相应代谢产物产量方 面的工作，可认为是微生物定向培育技术的一 大进展。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物 （即结构类似物），筛选抗异烟肼的菌株，可 得到吡哆醇的高产菌。
拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧 乙烷等除了能诱发各种点突变外，还能诱发一 般只有辐射才能诱发的染色体畸变，所以它们 也被称为拟辐射物质。
选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在 同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的 情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中， 尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选 用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG(N-甲基 -N’-硝基- N-亚硝基胍)。 采用简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。
诱变育种的基本环节
以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：
绝大多数
个体死亡
出发菌株 诱变
多数未变
少数存活
少数正变
多数幅度小 少数幅度大
少数突变 多数不宜投产 少数适宜投产
可计算：存活率 突变率 正变率 “高产率” “投产率”
挑选优良的出发菌株（original strain）
选用出发菌株的一般原则： ①最好是经过生产中选育过的自发变异菌株； ②采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低
处理单孢子（或单细胞）悬液
对单细胞微生物必须处理单细胞、均匀悬液的原因 分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂，避免长出不纯
菌落。 处理霉菌或放线菌孢子的原因：
丝状微生物的细胞内同时含有几个核，故某一突变无 法反映在当代的表型上。只有当经过DNA的复制发生 细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是 出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypic lag） （或由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单 链，也会出现表型延迟）。这也是诱变育种工作中初 分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主 要原因。