高压匀浆机
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高压匀浆法使用时注意事项



高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。
破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同
大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎； 生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基 上容易破碎。
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X-Press挤压机




改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的 高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋 在冰中的细胞变形所引起的。 主要用于实验室中。 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的 粉碎程度低以及活性的保留率高。 对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。
蔗糖酶
青霉素酰化酶
Saccharomyces Cerevisiae
Escherichia Coli
糖果、蜜饯
苄青霉素的脱酰作用
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表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名 宿主 用途
胰岛素 人生长激素（HGH）
α-干扰素
大肠杆菌 大肠杆菌
大肠杆菌
治疗糖尿病 治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血 病和卡波济肉瘤
机械破碎 物理破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
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化学破碎
酶促破碎
细胞破碎方法原理
分
机
高压匀浆法 液体剪切作用
液体剪切作用 固体剪切作用 酶分解作用
类
珠磨法
作 用 机 理
固体剪切作用
适
应
性
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
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概述
不同类型细胞生产目标产物的类型：

动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/霉菌等）胞内、胞外
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概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，
及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是
外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、 菌龄、外界环境等。
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植物细胞壁的结构

对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生 壁两部分。
初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～ 3μm），富有弹性。 初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维 素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚 糖，许多这样的长链形成微纤丝。 它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。
细胞
动物细胞 革兰氏阴性芽孢杆菌和球 菌 革兰氏阳性芽孢杆菌 酵母 革兰氏阳性球菌 孢子 菌丝
声波
7 6 5 3.5 3.5 2 1
搅拌
7 5 (4) 3 (2) (1) 6
液压
7 6 5 4 3 2 (1)
冷冻压力
7 6 4 2.5 2.5 1 5
注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。
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植物次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4μm以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增 加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则， 而且存在木质素的沉积。 因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性， 使植物细胞具有很高的机械强度。
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红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的 混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
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微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的 组成以及它们之间相互关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键。
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
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第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
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细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
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n
细胞破碎（cell disruption）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来 的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质 （产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认 为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
n
n
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细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
使细胞具有一定的形状和强 度。
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细菌细胞壁结构



破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。网状结构越致 密，破碎的难度越大。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很 大不同。革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳 性细菌的坚固。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。
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图1 革兰氏菌细胞壁结构图
（a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌
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酵母的细胞壁结构
最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了 细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状； 上面的是一层糖蛋白； 最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接 成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复 合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交 联的紧密程度和它的厚度。
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n
n
不同种类的细胞结构差别很大，破碎的 难易程度也不同，由难到易的大致排列 顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌） ＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞ 动物细胞。
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第二节 细胞破碎技术
以大肠杆菌为 宿主的药物多 为胞内产物 n
n
目的：释放细胞内含物。 分类：按照是否存在外加作用力
分为机械法和非机械法。 问题： 破碎率是否越高越好？
第四章 细胞的破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 预处理和固液分离 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 细胞破碎 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥)
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路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
本章的主要内容
◆压力 ◆温度 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450750kg/m3时，温度由300C提高到500C，破碎率 约提高1.5倍。 ◆通过均浆器阀的次数
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图7 细胞浓度及压力大小对破碎率的影响
匀浆次数 40 图8 匀浆次数对破碎效果的影响
影响高压匀浆器细胞破碎因素

升高压力有利于破碎




减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几 乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p 超生一定值时，R增加但很慢。 在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。
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破碎方式 机械法 非机械法
固体剪切 作用 压榨 研磨
液体剪切 作用 高 压 匀 浆 超 声 破 碎
干燥 处理 酶溶法
溶胞 作用 化学法 物理法
珠磨法
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细胞破碎方法分类
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
30Βιβλιοθήκη 高压匀浆阀结构示意图出液口
进液口
高压匀浆器
阀杆 阀座 碰撞环
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高压匀浆器
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标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
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大、中、小型高压匀浆器
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高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多：


WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
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高压匀浆法适用的范围
是大规模细胞破碎的常用方法 ☆高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 ☆不宜使用高压匀浆法的情况：