2、菌种保藏的原理
➢ 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造 条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减 少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低 水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠” 状态，抑制其繁殖能力。
➢ 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优 良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经 济，以便生产上能推广使用。
第二章 菌种与种子扩大培养
本章讲述内容
❖ 第一节 微生物工业用菌种 ❖ 第二节 种子扩大培养
第一节 微生物工业用菌种
一、菌种的分离筛选 1、菌种的来源 ❖ 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂
或菌种保藏部门索取或购买； ❖ 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
2、分离思路
❖ 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
二、菌种的保藏与复壮
（一）菌种的保藏
1、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料， 特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、 酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行 微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设 法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转 化。
D真空冷冻干燥保减法（细菌，防线菌 ）
真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度 下（－15℃），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。 在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。
因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备， 要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外 都已较普遍地应用。
• 划线分离法——平板划线法
（4）筛 选
分初筛、复筛。
Ⅰ、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 筛选出来的过程。
一般采用平板筛选。
常用的初选方法：
• 水解酶产生菌的筛选： 将酶的作用底物加在培 养基中，接种后适温培 养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解 酶产生菌。
• 拮抗菌的筛选—对峙培养： 将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株。
2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。
Ⅱ、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。
• 复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法 进行测定。
• 复筛过程中，要结合培养条件进行。 培养条件包括：培养基 pH值 发酵温度 供氧量等。
（5）菌种鉴定
❖ 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
❖ 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
（1）采样
❖ 采样对象：以采集土壤为主。 ❖ 采样季节：以温度适中，质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放 线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗 性真菌。
一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、 霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。
C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ）
这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。 它的制备方法是：
首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l－2∶l 混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右， 121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80 目过筛，土用30－100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬 浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥 器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期可达2-10年 不等。
❖ 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 征、血清学试验等。
❖ 现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
（6）毒性试验
❖ 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
❖ 离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含 菌量最高。
❖ 采土季节以春秋两季最好。 ❖ 采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，
盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、 地点、植被情况等。 ❖ 多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分 布平均情况
（2）增殖培养
❖ 含有目的菌较多的土样不需要富集培养 ❖ 如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的
基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖， 从而提高它们在样品中的比例，便于分离。 ❖ 富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无 关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体 中比例上升的目的。 ❖ 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或 者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这 一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可 能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 ❖ 一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通 过大量艰苦的工作筛选取得。
3、菌种保藏的方法
菌种保藏的方法很多，一般有下面几种： A 斜面冰箱保藏法（酵母）
斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条 件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个 月到六个月。
B 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面
（3）培养分离
❖ 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。