小鼠脾脏单个核细胞的分离
一、实验目的
1. 熟悉细胞分离的基本原理
2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法
3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法
二、实验原理
1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。

丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。

通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。

2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。

人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。

三、实验材料
小鼠
手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板
平皿，尼龙膜指套、研磨棒、
吸管、试管、EP管、移液器和tips
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板
0.2%台盼蓝染液
8.显微镜
四、实验步骤
（一）取小鼠脾脏
1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。

2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。

（二）制备单个核细胞悬液：
1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。

用针芯轻轻碾磨使
单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可
冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。

弃去上清，弹散细胞沉淀，加
ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。

然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞
悬液。

(放置冰上)
4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）
5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度
a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。

2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数；
3.细胞计数：细胞浓度（个/mL)=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）
×104×稀释倍数。

每个脾脏的总细胞数：细胞浓度（个/mL) ×10mL
注：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细胞无反光，则为死细胞；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个细胞中活细胞的百分率，一般活力应在95%以上。

注意事项：
1.通常分离细胞是为了下一步实验。

有些实验如需要对细胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。

2.在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他细胞。

五、实验数据处理和分析
从EP管中取出悬好的单个核细胞10μl后，加入40μlPBS，再加入50μl台盼蓝染料，然后吸取一滴于细胞计数板上，此时稀释倍数为10倍，然后于镜下计数得4个大方格的活细胞+死细胞个数为——
293+1、305+5、309+3、353+3
计算得本次取出的单个核细胞浓度为3.15*107个/ml。

活细胞百分率为：99.06%。

由于后面流式所需脾脏细胞个数为1x106-5x106，所以本小组吸取了已提取细胞液160μl，约5x106个细胞进行离心，用以流式分选。

六、经验总结与思考
个人认为在处死小鼠时新手不熟练使用颈椎脱位法太过于残忍，有很多同学把尾巴扯断，希望老师以后教学时能换一种处死方式如腹腔注射等。

由于脾脏紧靠肋弓，所以取脾脏时侧卧位要比直接开腹腔更方便寻找脾脏，也不容易导致失手将脾脏剪断的现象发生。

在血红细胞表面上有红细胞专属的表面抗原,当裂解液中含可以攻击特定红细胞表面抗原的酶的时候只会造成红细胞的变形,生物通道扩大,膨胀,裂解,或者引起红细胞的变性，而不会攻击其他细胞。

另外红细胞有自己的电负性,渗透脆性(通常是一些非酶细胞裂解液的突破点) ,悬浮稳定性,红细胞裂解液就是利用这些特性裂解红细胞。

本次实验中第一次裂解离心后发现细胞沉底中仍有红细胞存在，因此又重复裂解了一次，直到沉淀红色不明显才停止。

经过思考我认为短时多次的重复要优于少次长时的裂解，因为红细胞裂解液不能完全保证不损伤白细胞，所以太长时间的裂解也会影响提取所得白细胞的数量。