1型与2型糖尿病大鼠周围神经病变的比较杨丹;崔雅忠;张倩;王超;张改丽;梁晓春;吴群励【摘要】目的观察链脲佐菌素(STZ)诱导的1型与2型糖尿病大鼠周围神经病变的区别.方法 SD大鼠分组,每组各10只,腹腔注射STZ建立1型糖尿病(T1DM)模型;高脂高糖饲养6周后按体质量35 mg/kg单次腹腔注射STZ建立2型糖尿病(T2DM)模型;设立正常对照(Con)组.检测不同时间点大鼠的体质量、血糖水平.成模8周后,电子Von Frey仪检测机械痛阈值,热水甩尾试验检测甩尾潜伏期,并取坐骨神经进行病理形态学检查.结果成模后第1、8周,与对照组及T2DM组相比,T1DM 组大鼠的体质量显著下降(P<0.01);T1DM组与T2DM组的血糖均显著高于对照组(P<0.01);DM组的甩尾潜伏期均较对照组延长(P<0.01),T2DM组较T1DM组延长更显著(P<0.05).DM组的机械痛阈值均较对照组显著降低(P<0.01),T2DM组较T1DM组降低更明显(P<0.01);DM组大鼠的坐骨神经有髓神经纤维排列紊乱,轴索肿胀或皱缩,髓鞘密度不均匀,空泡变性,部分神经纤维髓鞘脱失;T2DM组的神经损害程度较T1DM严重.结论 STZ诱导的2型糖尿病大鼠的周围神经病变程度严重于1型糖尿病大鼠.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2019(039)001【总页数】5页(P27-31)【关键词】糖尿病周围神经病变;链脲佐菌素;机械痛阈;热水甩尾试验;病理形态【作者】杨丹;崔雅忠;张倩;王超;张改丽;梁晓春;吴群励【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中医科北京协和医院转化医学中心,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中医科北京协和医院转化医学中心,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中医科北京协和医院转化医学中心,北京100730;中日友好医院中西医结合肿瘤内科,北京100029;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中医科北京协和医院转化医学中心,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中医科北京协和医院转化医学中心,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中医科北京协和医院转化医学中心,北京100730【正文语种】中文【中图分类】R74糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)的发病率高达50%以上，而50%以上的DPN患者具有疼痛症状，可表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏，极大影响生活质量。
目前有关糖尿病神经痛的确切病理生理机制尚未清楚[1]。
随着中国经济的发展和人们生活方式的改变，中国已经成为全世界糖尿病(diabetes mellitus, DM)第一大国，成年人口发病率高达11.6%，且2型糖尿病占糖尿病总体人群的90%以上[2]。
因此，建立理想的糖尿病神经病理性疼痛模型，对于研究DPN疼痛的发病机制、治疗和预防十分重要。
本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导1型和2型糖尿病大鼠模型，观察两者间周围神经病变的变化。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物及饲料：SPF级6～7周龄雄性SD大鼠，体质量180～200 g(北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：京2007-0101)。
高脂高糖饲料配方：猪油10%、蔗糖20%、胆固醇2.5%、胆酸盐0.5%、基础饲料67%(北京科奥协力公司)。
1.1.2 主要试剂：链脲佐菌素(streptozotocin,STZ，Sigma-Aldrich公司)、血糖仪(Roche公司)。
1.2 方法1.2.1 动物分组及处理：适应性喂养大鼠3 d。
10只于实验开始即第0周喂以高脂高糖饲料，饲养6周禁食12 h后按35 mg/kg单次腹腔注射2% STZ溶液(pH 4.4)，建立2型糖尿病模型(T2DM组)。
20只喂以普通饲料，其中10只饲养6周禁食12 h后按60 mg/kg单次腹腔注射STZ溶液(同上)，建立1型糖尿病(T1DM 组)；另外10只为正常对照组(Con组)。
造模3 d后测定大鼠尾静脉血糖，随机血糖>16.7 mmol/L者入选实验。
1.2.2 体质量及血糖：各组大鼠于实验第0、6周以及成模后第1、8周时用血糖仪测定尾静脉血糖并称量体质量。
1.2.3 热水甩尾试验：成模8周后，将大鼠固定于固定器露出尾部，在距尾尖5cm处作一记号。
待大鼠状态安静后，将鼠尾持续浸泡在50 ℃的恒温热水中，尾尖浸入热水至记号处，用秒表测定大鼠尾巴快速弹起的时间，即甩尾潜伏期(tail flick latency, TFL, s)，鼠尾浸泡时间不要超过15 s以免烫伤组织。
每隔2 min测1次，连测3次。
1.2.4 检测机械痛阈值：成模8周后，在安静环境中，将大鼠单独置入多孔钢丝笼中。
待大鼠适应环境15 min后，以电子von Frey刺激针刺激大鼠后肢足底中部，力度由小到大逐渐增加，当大鼠出现缩足反应时，记录von Frey电子记录仪上显示的压力数值。
每只大鼠刺激3次，间隔时间大于30 s，取平均值作为大鼠的机械痛阈值。
1.2.5 坐骨神经病理形态学变化：完成感觉检测后，腹腔注射12%乌拉坦10mL/kg麻醉大鼠，取坐骨神经，4%甲醛固定，进行HE染色、Luxol fast blue中性红髓鞘染色及Bielschowsky氏改良法神经纤维轴索染色。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0，计量资料以均数±标准差表示，多组采用单因素方差分析。
2 结果2.1 一般情况、血糖及体质量第6周时，高脂高糖组的体质量显著高于普通饲料组(P<0.01)。
DM组大鼠出现多饮、多食和多尿，精神萎靡，活动减少和白内障。
实验过程中，T1DM组死亡2只，T2DM组死亡3只。
第1和第8周，与对照组及T2DM组相比，T1DM组大鼠的体质量显著下降(P<0.01)。
T1DM组与T2DM组的血糖在成模后第1、8周，均显著高于对照组(P<0.01)(表1)。
2.2 热水甩尾试验及机械痛阈值检测T2DM及T1DM组的甩尾潜伏期均较对照组延长(P<0.01)，T2DM组较T1DM组延长更显著(P<0.05)。
T2DM及T1DM组的机械痛阈值均较对照组显著降低(P<0.01)，T2DM组较T1DM组降低更明显(P<0.01)(表2)。
2.3 坐骨神经病理形态学变化2.3.1 HE染色：对照组大鼠坐骨神经有髓神经纤维形态正常，排列整齐，纤维中央深红色区域为轴索。
轴索外包绕有髓鞘，结构完整清晰，因髓磷脂在制片中被溶解，呈紫红色网状结构。
髓鞘边缘可见蓝色的雪旺细胞核。
T1DM和T2DM组大鼠的坐骨神经有髓神经纤维排列紊乱，轴索肿胀或皱缩，髓鞘密度不均匀，空泡变性，部分神经纤维髓鞘脱失。
T2DM组的神经损害程度较T1DM重(图1)。
2.3.2 Luxol fast blue中性红髓鞘染色：对照组大鼠坐骨神经纤维分布均匀，排列紧密整齐，有髓神经纤维形态正常。
神经髓鞘染色均匀，结构完整清晰，形态正常，无髓鞘溶解。
T1DM和T2DM组大鼠坐骨神经纤维排列紊乱，密度下降。
髓鞘肿胀，轴索萎缩甚至消失；部分神经纤维髓鞘溶解脱失，染色不均、呈洋葱皮样改变。
T2DM组病变较T1DM组严重(图2)。
表1 各组大鼠体质量及血糖Table 1 Body weight and blood glucose of ratsgroupnbody weight/gblood glucose/(mmol/L)1 week 8 weeks1 week8 weeksCon10440±32537±385.70±0.695.79±0.68T1DM8330±41*409±45*23.69±2. 80*23.82±3.64*T2DM7 421±35△530±38△23.25±2.63*24.02±3.03**P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with T1DM group.表2 各组大鼠热水甩尾试验及机械痛阈检测结果Table 2 Tail flick latency and mechanical withdrawal threshold of ratsgroupntail flicklatency/smechanical withdraw althreshold/gCon105.95±1.13 84.30±6.64T1DM89.53±2.02*52.80±7.67*T2DM7 11.91±2.95*△ 41.72±6.65*△△*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with T1DM group.2.3.3 Bielschowsky氏改良法神经纤维轴索染色：对照组大鼠坐骨神经纤维形态饱满正常，排列紧密整齐，轴索结构清晰，分布密集，髓鞘薄厚均匀。
T1DM和T2DM组大鼠坐骨神经表现出明显的神经损伤反应，神经纤维排列紊乱，神经纤维变细，密度下降。
部分轴索肿胀，空泡变性，染色变淡；部分轴索皱缩，被变性的髓鞘挤压成不规则型甚至消失。
T2DM组病变较T1DM组严重(图3)。
HE staining of sciatic nerves was indicated by arrows图1 各组坐骨神经组织的HE染色Fig 1 HE staining of sciatic nerves (×400)Luxol fast blue staining of sciatic nerves was indicated by arrows图2 各组坐骨神经组织的Luxol fast blue髓鞘染色Fig 2 Luxol fast blue staining of sciatic nerves(×400)Bielschowsky staining of sciatic nerves was indicated by arrows图3 Bielschowsky氏改良法神经纤维轴索染色Fig 3 Modified Bielschowsky staining of sciatic nerves(×400)3 讨论疼痛是DPN患者最常见、最突出的症状和首要就诊原因[1]，但因发病机制尚未完全阐明，目前缺乏有效特异性治疗手段。