• 盐溶：低浓度时中性盐能增加蛋白 质的溶解度 • 盐析：当溶液的离子强度增大到一 定数值时，溶解度开始下降，当离 子强度达到足够高时，许多蛋白质 从水溶液中沉淀出来
有机溶剂沉淀法
在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由 于这些溶剂与水的亲和力强，能破坏蛋白质的水化层，使 蛋白质的溶解度下降而沉淀。
利用这种吸附能力的差异，可将蛋白质进行分离。
应用最广的吸附剂：结晶磷酸钙
亲和色谱法
不同蛋白质分子对固定在载体上的特殊配基具有不同 的识别和结合能力 常用的配基有：抗体、抗原、激素、受体蛋白等 将这种连有配基的载体装入色谱柱中，当含有待纯化 的蛋白质溶液通过色谱柱时，该蛋白与配基发生特异 性结合被吸附在色谱柱上，以适当的配体洗脱液洗脱。
2.4.3
蛋白质的分离和纯化
1.蛋白质的分离
蛋白质存在于生物体的组织细胞中，在分离纯化之前必须采 用适当方法使蛋白质以溶解状态释放出来
组织破碎 细胞破碎（研磨法、超声波法、冻融法、酶解法等）
细胞破碎后，各种蛋白质被释放出来，根据不同蛋白质的特 性，选择不同的溶剂进行抽提。
水溶性蛋白 脂溶性蛋白 缓冲溶液+盐溶 有机溶剂
蛋白质在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排 斥力最小，易聚集形成沉淀 当蛋白质混合物溶液的pH被调到某一成分的等电点时， 该蛋白质被沉淀出来 那些等电点高于或低于该pH的蛋白质仍留在溶液中
盐析法
盐析：大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入 蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因 素而沉淀 各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同.
无氧存在时，与水结合，生成脱氧血红蛋白（Hb）
有氧存在时，与氧结合成氧合血红蛋白（HbO2）
血红蛋白的主要功能是运输氧和CO2
呼吸作用产生的CO2能与氧合血红蛋白结合，促进 HbO2的分解
pH=7.2（肌肉）
HbO2 +
H
+
+ CO2
pH=7.6（肺）
HbHCO2 + O2 碳酸血红蛋白
可逆沉淀
通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中 沉淀分离，此过程中，结构和性质都没有发生变化 破坏了胶体溶液的稳定性 是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
不可逆沉淀
• 在强烈沉淀条件下，不仅破坏蛋白质胶体的稳定性，而且 也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的沉淀不可能再溶于 水。
• 造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重 金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。 • 复性：有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，能恢 复活性。
5、蛋白质的紫外吸收
Trp、Tyr、Phe在280nm处有特征吸收峰，可作蛋白质 定量测定
6、蛋白质的呈色反应
双缩脲反应
氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度。 米伦反应 蛋白质黄色反应 乙醛酸反应 坂口反应 酚试剂反应
蛋白质黄色反应
• 蛋白质溶液加硝酸后产生白色沉淀，加热后白色沉淀变黄 色，再加碱，颜色加深为橙黄色。 • 原理：硝酸将蛋白质分子中苯环硝化，产生黄色硝基苯衍 生物 • 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及含有苯丙氨酸、酪氨酸、色 氨酸的蛋白质有此反应
乙然后沿试管壁慢慢注入浓硫 酸，在两液层间会出现紫色环 • 凡含有吲哚基的化合物都有此反应 • 色氨酸及含色氨酸的蛋白质有此反应
常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等
为防止蛋白质在此过程中变性，有机溶剂浓度不能太高， 需在低温条件下进行。
3) 根据电性质不同的分离方法
离子交换法 电泳法
离子交换法
利用离子交换树脂做柱色谱支持物，将带有不同电荷 的蛋白质进行分离的方法。
在蛋白质的分离中最常用的是阳离子交换树脂 固定相 负电荷 交换相 正电荷
角蛋白
•毛发、指甲、羽毛为角蛋白。
分为：α-角蛋白、 β-角蛋白
哺乳动物角蛋白为α-角蛋白
α-角蛋白由α螺旋构象的多肽链组成 3条α螺旋 原纤维
• α-角蛋白富含半胱氨酸,并与邻近的多肽链交 联,形成二硫键,因此α-角蛋白很难溶解,不溶 于水，为硬蛋白，也经受得起一定的拉力。
• α-角蛋白被过渡拉伸时，氢键被破坏不能复 原，转变为β折叠结构，称为β-角蛋白 • 鸟类及爬行类为β-角蛋白。
当蛋白质混合物溶液的pH<所含蛋白质的pI时，各种不 同的蛋白质都带正电荷 将这种蛋白质混合溶液加到色谱柱后，带正电荷的蛋白 质颗粒即与H+进行交换被吸附在树脂上
带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的 蛋白质与树脂结合较弱 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl进行梯度洗脱，通 过Na+的离子交换作用，可将带有不同正电荷的蛋白质 进行分离。
• 毛料衣服易被蛀掉: • 是由于一类蛾的幼虫消化液中有大量巯基化合 物，使二硫键还原成巯基，肽链之间的聚合被 解除，肽链被消化。 • 烫发剂，含巯基化合物，打开二硫键
• 固定剂，氧化剂，重建二硫键
丝蛋白
• 丝蛋白是反向β折叠，牢固但不能拉伸 • 丝蛋白肽链通常由六肽单元重复而成
(Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n
用已知相对分子量的蛋白质作
为标准，可估算出不同蛋白质 的相对分子量。
在一定的凝胶浓度下，
标准蛋白分子量
多肽链分子量的对数与
多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通
过标准曲线求未知多肽
链分子量。 未 知 蛋 白
相对迁移率
4) 根据吸附性质不同的分离方法
吸附色谱法
某些物质对不同种类的蛋白质具有不同程度的吸附能力。
在pH<pI溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动;
这种现象称为蛋白质电泳。
利用蛋白质的电泳现象，可将蛋白质进行分离纯化 .
2、蛋白质的胶体性质
蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体 这是因为：
蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水
基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；
CH2 CH H3C N Fe N H3C CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH N CH3 N
吡咯
CH3 CH CH2
血红素
血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配位键与肽 链分子中组氨酸咪唑基的N原子相连
O2 CO2
His
CO HCO2H+
血红蛋白中，血红素Fe原子的第6配位键可与不同 的分子结合
另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质
颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀
3、蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性与它的相对分子量大小、所带的 电荷、水化作用有关。 改变溶液的条件，破坏蛋白质胶体的稳定性，在适当的条 件下，蛋白质能从溶液中沉淀出来 沉淀可分为：可逆沉淀、不可逆沉淀
电泳法
蛋白质溶液的pH≠pI时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷 由于蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场 中移动的速率也不同
v
Eq f
蛋白质与介质的摩擦系数
如果能创造条件，使Eq接近一个常数，则移动速率只与f即分子大小 有关，这样就能将蛋白质按分子大小不同进行分离。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
得到的粗提物，经离心 盐析、等电点沉淀、有机溶剂 沉淀 蛋白质粗产品
2.蛋白质的纯化
大小 纯化原理根据蛋白质具有不同的 溶解度
电荷
吸附性
3.蛋白质分离纯化的基本方法
1)根据分子大小不同的分离方法
透析法 离心沉降法 凝胶色谱法
透析法:根据分子量的大小，用透析袋将大、小分子
物质分开。
2.4.2
蛋白质的性质
1、蛋白质的两性解离和电泳现象
蛋白质与多肽一样，能够发生两性解离，也有等电点。 蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最 小，在电场中不向阳极也不向阴极移动。
在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。
在pH>pI溶液中,蛋白质粒子带负电荷,在电场中向正极移动;
米伦反应
• 米伦试剂：硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物 • 蛋白质溶液加入米伦试剂即产生白色沉淀，加热后沉淀 变红色。 • 酚类化合物、酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质有此反应。
酚试剂反应
• 酪氨酸中的酚基能将酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝 色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物） • 由于蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，所以可用此反应测 定蛋白质含量
，故样品 即是。 色的物质， 色的物质。
• 3、镰刀状贫血症是最早认识的一种分子病，患者的血 红蛋白分子亚基的第六位 氨酸被 氨酸所 替代，前一种氨基酸为 性侧链氨基酸，后者 为 性侧链氨基酸，这种微小的差异导致血 红蛋白分子在氧分压较低时易于聚集，氧合能力下降， 而易引起溶血性贫血。
离心沉降法
先加入适当的沉淀剂，将蛋白质溶液转成悬浮液，在不 同的离心速度下，使不同大小和密度的蛋白颗粒分离。 高速离心机（50000rpm/min以下） 超速离心机（60000rpm/min以上）
凝胶色谱法
2)利用溶解度不同的分离方法
等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
2.4.4
• • • •
几种重要的蛋白质类型
蛋白质是生命活动的体现， 依据形状可分为纤维蛋白和球形蛋白； 依据组成可分为简单蛋白和结合蛋白； 依据功能可分为催化剂蛋白、结构蛋白、参与生理活动蛋 白、储存氨基酸蛋白、 氧化供能蛋白等。
纤维状蛋白:角蛋白、丝蛋白 球状蛋白：血红蛋白、抗体
1.纤维状蛋白
坂口反应
• 精氨酸分子中的胍基能与次氯酸钠及α萘酚在氢氧化钠溶 液中产生红色产物 • 此反应可用来鉴定含有精氨酸的蛋白质 • 也可定量测定精氨酸的含量