免疫组织化学得基本知识1免疫组织化学得概念:免疫组化就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为免疫组织化学、2免疫组化实验所用得抗体有哪些？ﻫ免疫组化实验中常用得抗体为单克隆抗体与多克隆抗体、单克隆抗体就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备、多克隆抗体就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物、ﻫ3免疫组化实验所用得组织与细胞标本有哪些?实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,细胞标本包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片、其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本得方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定得影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选得组织标本制作方法。
ﻫ4石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法?石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成得交联破坏,而恢复抗原得原有空间形态。
ﻫ常用得抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用得修复液就是ｐH6、０得0、01 mol/L得柠檬酸盐缓冲液、5免疫组化常用得染色方法有哪些？ﻫ根据标记物得不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础得检测方法。
这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平得定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。
6抗体交叉反应得原因:指抗体除与其相应得抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应、产生得原因有以下几个方面:1、抗原特异性指用于免疫动物得抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产生针对多种抗原分子特异性得相应抗体、任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同得抗原分子,必将与上述多特异性得抗血清发生交叉反应、2、共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同得抗原决定簇。
ﻫ３。
决定簇相似,两种不同得抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇得相应抗体可以与大致相同得决定簇发生交叉反应。
当然抗原一抗体之间构象相似时得结合力小于吻合时得结合力。
ﻫ免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术得概述*免疫细胞化学(immuｎocytoｃｈeｍistｒy, ＩCC) ﻫ-就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原得成分(主要就是多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为～、ﻫ(一) 对抗原与抗体得要求ﻫ*具有特异性高与亲与力强得抗体就是实验成功得首要条件。
-对抗体得要求:纯度高、比活性强;*高度特异性抗体得获得,取决于抗原得纯度。
-对抗原得要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。
ﻫﻫ(二) 抗原 (antigen, Ａg) ﻫ＊抗原得概念:凡就是在机体内引起体液免疫与(或)细胞免疫反应得物质,称为抗原。
抗原具有两个方面得特性:—免疫原性:引起机体产生抗体与(或)致敏淋细胞得特性;—免疫反应性:抗原能与相应得抗体及致敏淋巴细胞发生特异得结合或反应得特性、＊根据抗原就是否显示免疫原性分为: ﻫ-完全抗原:分子量较大,一般在10kＤa以上,并具有较复杂得化学组成、*免疫原性最强得就是蛋白质抗原,多糖次之;脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好得免疫原性、ﻫ—半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。
例如:某些短肽、多糖、类脂与药物等、＊半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。
ﻫ载体ﻫ＊通常就是具有高度免疫原性得大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联得半抗原能力。
ﻫ—常用得载体有钥孔血蓝蛋白(keyｈoｌe lｉmpet hemocya ｎin,KLH)、牛血清白蛋白(boｖine sｅrum ａlbumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVＡ)等。
ﻫ—用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团－N Ｈ2、-COOＨ等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDａ结合5～25个分子得小肽、ﻫ(三)抗体 (ａｎｔibｏdy, Aｂ) ﻫ1、抗体得概念: ﻫ*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合得球蛋白,被称为抗体、—抗体主要存在于血清内; ﻫ-抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体、—免疫球蛋白根据重链得结构及抗原特异性不同分为五种,既IgＧ、 IgD、IgE、 I ｇA、ＩｇM、ﻫ2、免疫组化实验中常用得抗体:单克隆抗体与多克隆抗体。
*单克隆抗体:就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备得、ﻫ—特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体:就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物。
ﻫ—特异性低,会产生抗体得交叉反应。
ﻫ-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。
—抗原与抗体得结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。
3、抗体得制备——多克隆抗体得制备＊动物得选择*佐剂(adjuvaｎｔ)*免疫方法ﻫ＊免疫剂量ﻫ＊抗体效价得测定＊放血或定期抽血免疫组化常见问题及解决方法当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能得原因。
ﻫ对照/标本无染色①确认就是否忽略了应该加得某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等、②确认所有得试剂就是否按正确得顺序加入,就是否孵育了足够得时间。
ﻫ③对照抗体得标签确认就是否使用了正确得抗体,以及所用得检测系统就是否与一抗匹配,这一点就是非常重要得。
比如,如果一抗就是兔来源得抗体,二抗一定要用抗兔得二抗来匹配;或一抗就是小鼠得IgM一抗,二抗必须就是山羊/兔抗小鼠得Ｉg Ｍ(不就是IgＧ)二抗。
④检查抗体所使用得稀释度及稀释溶液、⑤检查抗体得有效期与保存条件,尤其就是标记了酶或荧光素得抗体,现在大多数试剂公司得抗体均要求在4~８℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体得效价。
⑥检查标本得储存条件,最好用已知阳性得标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/底物溶液,最简单得检测方法就是将一滴标记有酶得抗体加入到制备好得底物溶液中,如果底物发生预期得颜色变化,则可排除底物得因素。
需要注意得就是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。
⑧检查冲洗液就是否与反应试剂匹配,溶液得pH值很重要,与过氧化物酶底物匹配得溶液中不应含有叠氮钠。
ﻫ⑨检查复染剂与封片剂就是否与所使用得色原匹配。
弱阳性ﻫ如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外,还应考虑:ﻫ①标本得固定方式,不当得固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测得抗原得数量与质量。
ﻫ②不适当得抗原修复方式,由于石蜡切片在制作得过程中固定剂对抗原得封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用得抗原双暴露法,至于使用哪一种方法,应参照生产厂家得说明,同时结合标本得具体情况而定。
ﻫ③抗体得稀释度就是否过高或者孵育得温度/时间就是否正确、一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定得使用范围,但就是由于使用者得标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用得一抗进行梯度测试,找出最佳得使用浓度。
ﻫ④切片上遗留了过多得冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步得稀释。
⑤孵育时切片就是否放置水平,否则会导致抗体流失。
ﻫ如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能就是由于阳性对照不就是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
ﻫﻫ非特异性染色①就是否有效地去除了内源性酶与生物素。
应注意得就是,并不就是每一种组织均需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富得组织,如肝脏、肾脏等,需考虑此原因。
处理得方法为:ﻫ灭活碱性磷酸酶:最常用得方法就是将左旋咪唑(2４m ｇ/m1)加入底物液中,并保持pH值在7。
6～８。
2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色得酸性磷酸酶,可用50ｍmol/L得酒石酸抑制。
ﻫ饱与处理内源性生物素:消除内源性生物素得方法就是事先滴加亲与素,以饱与内源性生物素,使之不再有剩余得结合位点、具体方法就是在ABC法或SＰ法染色前将切片浸于25ｕg/ｍl亲与素溶液中处理15分钟,ＰBS清洗15分钟后即可染色。
②就是否选择使用了正确得封闭血清、电荷吸附所造成得非特异性背景染色消除方法就是以二抗动物得非免疫血清,用PBS稀释为3%-1０%溶液孵育切片,以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白,如牛血清白蛋白也常应用、另外,取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内得实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭,效果也不错、ﻫ③所选择得抗体就是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似得抗原决定簇等原因造成得非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价得抗体、或针对更具特异性抗原决定簇得单克隆抗体来解决。
④一抗得使用浓度就是否过高。
⑤清洗就是否充分、应严格操作规程、因在缓冲液中含有一定量得盐,这亦有利于减低背景着色,通常0.05mol/l Trｉｓ-HCl,０、15moｌ／ｌ NａＣl已适用于多数染色方法,溶液内加入吐温2０,效果更佳。
特殊标记时,试剂公司一般都提供缓冲液得配方。
⑥ＤBA得使用就是否正确。
ＤAB得孵育时间与配制方式可以产生某些背景颜色,使用浓缩型DAＢ试剂盒时,请严格按照说明书标明得滴加顺序操作,注意校正蒸馏水得pH值,以确保实验结果得正确性;粉剂DAB溶解时,常有一些不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上,产生斑点状着色。
另外,DAＢ保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上,因此需将ＤAB保存于避光干燥处,现用现配,临用前加H2O２。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中就是否曾经干涸,否则会造成边缘部得非特异性染色、⑧检查二抗与标本得内源性组织蛋白就是否有交叉反应、ﻫﻫ抗体得保存抗体储存容器应由不吸附蛋白质得材料制成,常用得有聚丙烯,聚碳酸酯与硼硅酸玻璃。
如储存得抗体中蛋白浓度很低(１０-100Mg／L),就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白得吸附,隔离蛋白常用0、１%－1.0%得牛血清白蛋白。